Optimización de condiciones experimentales para la identificación de L. chagasi analizando diferentes secuencias del genoma
La leishmaniasis visceral es una zoonosis grave causada por Leishmania donovani y Leishmania infantun/chagasi, para la cual los perros infectados son el principal reservorio. Con el objetivo de disponer de métodos específicos para la identificación del genoma de Leishmania chagasi en muestras de can...
Guardado en:
| Autores principales: | , , , , |
|---|---|
| Formato: | Reunión |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Veterinarias
2024
|
| Materias: | |
| Acceso en línea: | http://repositorio.unne.edu.ar/handle/123456789/55077 |
| Aporte de: |
| Sumario: | La leishmaniasis visceral es una zoonosis grave causada por Leishmania donovani y Leishmania
infantun/chagasi, para la cual los perros infectados son el principal reservorio. Con el objetivo de
disponer de métodos específicos para la identificación del genoma de Leishmania chagasi en
muestras de caninos se optimizaron las condiciones químicas y térmicas para la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) con la cual se amplificaron dos fragmentos diferentes de
Leishmania chagasi. Las reacciones fueron PCR sencillas llevadas a cabo con un volumen final de
25ul y contuvieron 1X de Buffer de PCR, 0,2gM de cada oligonucleótido cebador (RV1/RV2 o
LCS1/LCS3); 0,2mM de una mezcla equimolecular de dNTPs, 1U de Taq ADN polimerasa y 1,5 o
2,0mM MgCl2, según se utilicen los pares de primers RV1/RV2 dirigidos a una secuencia de ADN
altamente repetitiva del ADN kinetoplastidico o LCS1/LCS3 dirigidos a genes de ARNr18S. En
todos los casos se incorporaron controles positivos cedidos gentilmente por el Instituto Nacional
de Parasitología "Dr. Mario Fatala Chaben” y controles negativos consistentes en agua destilada.
Las condiciones térmicas para la amplificación mediada por primers RV1/RV2 fueron:
desnaturalización inicial: 94°C por 5min, luego 35 ciclos de desnaturalización a 94°C por 60seg;
pegado de primer: 59°C por 60seg; extensión: 72°C por 60seg; extensión final: 72°C por 5min;
incubación: 4°C hasta su utilización. Las condiciones térmicas para la amplificación mediada por
primers LCS1/LCS3 fueron: desnaturalización inicial: 94°C por 2min, luego 40 ciclos de
desnaturalización a 94°C por 30seg; pegado de primer: 55°C por 30seg; extensión: 72°C por 60seg;
extensión final: 72°C por 2min; incubación: 4°C hasta su utilización Los productos de
amplificación de ambas reacciones fueron fragmentos de 145pb y 259pb respectivamente. Éstos
fueron separados y visualizados por electroforesis en gel de agarosa 2%, teñidos con bromuro de
etidio y observados por transiluminación UV. Dada la elevada sensibilidad y especificidad de los
métodos moleculares, cuando fueron aplicados a muestras de control positivos ambas dieron
bandas de amplificación detectables del tamaño esperado, no observándose bandas en muestras
de ADN control correspondientes a Leishmanias braziliensis. |
|---|