Optimización de condiciones experimentales para la identificación de L. chagasi analizando diferentes secuencias del genoma
La leishmaniasis visceral es una zoonosis grave causada por Leishmania donovani y Leishmania infantun/chagasi, para la cual los perros infectados son el principal reservorio. Con el objetivo de disponer de métodos específicos para la identificación del genoma de Leishmania chagasi en muestras de can...
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| Formato: | Reunión |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Veterinarias
2024
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| Acceso en línea: | http://repositorio.unne.edu.ar/handle/123456789/55077 |
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I48-R184-123456789-550772024-10-23T11:13:57Z Optimización de condiciones experimentales para la identificación de L. chagasi analizando diferentes secuencias del genoma De Biasio, María Bárbara Esquivel, Graciela Patricia Vega, Lucas Jastrzebski, Fernando Alberto Almirón, Enrique Celso PCR Zoonosis Visceral La leishmaniasis visceral es una zoonosis grave causada por Leishmania donovani y Leishmania infantun/chagasi, para la cual los perros infectados son el principal reservorio. Con el objetivo de disponer de métodos específicos para la identificación del genoma de Leishmania chagasi en muestras de caninos se optimizaron las condiciones químicas y térmicas para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con la cual se amplificaron dos fragmentos diferentes de Leishmania chagasi. Las reacciones fueron PCR sencillas llevadas a cabo con un volumen final de 25ul y contuvieron 1X de Buffer de PCR, 0,2gM de cada oligonucleótido cebador (RV1/RV2 o LCS1/LCS3); 0,2mM de una mezcla equimolecular de dNTPs, 1U de Taq ADN polimerasa y 1,5 o 2,0mM MgCl2, según se utilicen los pares de primers RV1/RV2 dirigidos a una secuencia de ADN altamente repetitiva del ADN kinetoplastidico o LCS1/LCS3 dirigidos a genes de ARNr18S. En todos los casos se incorporaron controles positivos cedidos gentilmente por el Instituto Nacional de Parasitología "Dr. Mario Fatala Chaben” y controles negativos consistentes en agua destilada. Las condiciones térmicas para la amplificación mediada por primers RV1/RV2 fueron: desnaturalización inicial: 94°C por 5min, luego 35 ciclos de desnaturalización a 94°C por 60seg; pegado de primer: 59°C por 60seg; extensión: 72°C por 60seg; extensión final: 72°C por 5min; incubación: 4°C hasta su utilización. Las condiciones térmicas para la amplificación mediada por primers LCS1/LCS3 fueron: desnaturalización inicial: 94°C por 2min, luego 40 ciclos de desnaturalización a 94°C por 30seg; pegado de primer: 55°C por 30seg; extensión: 72°C por 60seg; extensión final: 72°C por 2min; incubación: 4°C hasta su utilización Los productos de amplificación de ambas reacciones fueron fragmentos de 145pb y 259pb respectivamente. Éstos fueron separados y visualizados por electroforesis en gel de agarosa 2%, teñidos con bromuro de etidio y observados por transiluminación UV. Dada la elevada sensibilidad y especificidad de los métodos moleculares, cuando fueron aplicados a muestras de control positivos ambas dieron bandas de amplificación detectables del tamaño esperado, no observándose bandas en muestras de ADN control correspondientes a Leishmanias braziliensis. 2024-09-03T16:07:17Z 2024-09-03T16:07:17Z 2021-11-25 Reunión De Biasio, María Bárbara et al., 2021. Optimización de condiciones experimentales para la identificación de L. chagasi analizando diferentes secuencias del genoma. En: XLI Sesión de Comunicaciones Científicas. Corrientes: Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Veterinarias, p. 10-10. 2451-6732 http://repositorio.unne.edu.ar/handle/123456789/55077 spa openAccess http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/ application/pdf p. 10-10 application/pdf Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Veterinarias |
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La leishmaniasis visceral es una zoonosis grave causada por Leishmania donovani y Leishmania
infantun/chagasi, para la cual los perros infectados son el principal reservorio. Con el objetivo de
disponer de métodos específicos para la identificación del genoma de Leishmania chagasi en
muestras de caninos se optimizaron las condiciones químicas y térmicas para la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) con la cual se amplificaron dos fragmentos diferentes de
Leishmania chagasi. Las reacciones fueron PCR sencillas llevadas a cabo con un volumen final de
25ul y contuvieron 1X de Buffer de PCR, 0,2gM de cada oligonucleótido cebador (RV1/RV2 o
LCS1/LCS3); 0,2mM de una mezcla equimolecular de dNTPs, 1U de Taq ADN polimerasa y 1,5 o
2,0mM MgCl2, según se utilicen los pares de primers RV1/RV2 dirigidos a una secuencia de ADN
altamente repetitiva del ADN kinetoplastidico o LCS1/LCS3 dirigidos a genes de ARNr18S. En
todos los casos se incorporaron controles positivos cedidos gentilmente por el Instituto Nacional
de Parasitología "Dr. Mario Fatala Chaben” y controles negativos consistentes en agua destilada.
Las condiciones térmicas para la amplificación mediada por primers RV1/RV2 fueron:
desnaturalización inicial: 94°C por 5min, luego 35 ciclos de desnaturalización a 94°C por 60seg;
pegado de primer: 59°C por 60seg; extensión: 72°C por 60seg; extensión final: 72°C por 5min;
incubación: 4°C hasta su utilización. Las condiciones térmicas para la amplificación mediada por
primers LCS1/LCS3 fueron: desnaturalización inicial: 94°C por 2min, luego 40 ciclos de
desnaturalización a 94°C por 30seg; pegado de primer: 55°C por 30seg; extensión: 72°C por 60seg;
extensión final: 72°C por 2min; incubación: 4°C hasta su utilización Los productos de
amplificación de ambas reacciones fueron fragmentos de 145pb y 259pb respectivamente. Éstos
fueron separados y visualizados por electroforesis en gel de agarosa 2%, teñidos con bromuro de
etidio y observados por transiluminación UV. Dada la elevada sensibilidad y especificidad de los
métodos moleculares, cuando fueron aplicados a muestras de control positivos ambas dieron
bandas de amplificación detectables del tamaño esperado, no observándose bandas en muestras
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