Relevancia de la expresión de Tristetraprolina (TTP) en el mantenimiento del compartimento progenitor del epitelio mamario

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La estabilidad de los ARN mensajeros (ARNm) está controlada por proteínas que se unen a secuencias enriquecidas en adenina y uracilo (ARE) en sus regiones 3' no traducidas (3'UTR) denominadas colectivamente proteínas de unión a AU (AUBP). Esta Tesis se centra en el análisis del papel bioló...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Stedile, Micaela Nadia
Formato:	Tesis Doctoral
Lenguaje:	Español
Publicado:	3 de
Materias:	TRISTETRAPROLINA GLANDULA MAMARIA APOPTOSIS CELULAS PROGENITORAS/MADRE RESPUESTA INFLAMATORIA TRISTETRAPROLIN MAMMARY GLAND PROGENITOR/STEM CELLS INFLAMMATORY RESPONSE
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7201_Stedile
Aporte de:	Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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description	La estabilidad de los ARN mensajeros (ARNm) está controlada por proteínas que se unen a secuencias enriquecidas en adenina y uracilo (ARE) en sus regiones 3' no traducidas (3'UTR) denominadas colectivamente proteínas de unión a AU (AUBP). Esta Tesis se centra en el análisis del papel biológico en la glándula mamaria de una AUBP en particular llamada Tristetraprolina (TTP). TTP modifica decaimiento de sus transcriptos blanco, muchos de las cuales codifican para citoquinas proinflamatorias (TNFα, IL-6, LIF, CSF2, IL-10), pero también para oncoproteínas, como c-Myc, Ciclina D1, VEGF y metaloproteinasas, entre otras. De acuerdo con ello, los niveles de TTP están reducidos en diferentes tipos de tumores, incluido el cáncer de mama, respecto al tejido normal. Comprender la función fisiológica de TTP en la glándula mamaria adulta nos ayudaría a determinar cómo la reducción en su expresión podría facilitar el crecimiento tumoral. En este sentido, nuestro grupo ha demostrado que, en la glándula mamaria, la expresión de TTP está aumentada en ratones hembra durante la lactancia y este efecto puede ser imitado por el tratamiento con prolactina en cultivo celular. En ratones TTP knockout condicionales (MG-TTP KO) obtenidos cruzando ratones TTPfl/fl con animales transgénicos WAP-Cre, hemos determinado que la pérdida de TTP en la glándula mamaria durante la lactancia afecta la alimentación de las crías e induce una involución precoz. Para explorar los resultados de la deficiencia de TTP en etapas tempranas del desarrollo, trasplantamos tejido de glándula mamaria de ratones TTP-KO vírgenes en almohadillas de grasa depletadas de su propio epitelio correspondientes a hembras receptoras wild type (WT). Después de 10 semanas, las hembras trasplantadas con epitelio mamario TTP-KO mostraron una morfogénesis deficiente en comparación con los implantes mamarios control. Estos datos sugirieron un impacto de TTP en las células indiferenciadas que impulsan el desarrollo de la glándula mamaria. En esta Tesis probamos la hipótesis mencionada anteriormente en primer lugar a través de la generación y análisis de una línea celular con menor expresión de TTP (TTP-KD) producida por transfección estable de células epiteliales mamarias HC11 con shRNA específicos para el ARN de TTP. Elegimos esta línea celular porque poseen propiedades stem, similares a las células progenitoras mamarias in vivo. Curiosamente, las células TTP-KD mostraron una reducción en sus tasas de supervivencia, aumento de la apoptosis y niveles incrementados de proteínas pro-apoptóticas como la caspasa 3 clivada (CC3) y BAX. Fenotípicamente, las células TTP-KD revelaron una capacidad disminuida para formar mamosferas en cultivo 3D y repoblar las almohadillas de grasa clareadas de ratones hembra BALB/c vírgenes a 10 semanas post implantación. Estos resultados indican que la muerte celular observada podría haber tenido un impacto significativo en el compartimento de células progenitoras mamarias. Hemos encontrado que las células TTP-KD mostraron una elevada expresión de los mensajeros Il-6 y Tnfα, dos blancos conocidos de TTP que codifican para citoquinas inflamatorias. De forma acorde, estas células presentaron niveles aumentados de fosfo-STAT3 y fosfo-p65 o subunidad RelA de NF-κB, proteínas cuyas vías correspondientes son activadas por IL-6 y TNFα, respectivamente. Ambas vías de señalización están implicadas en la apoptosis y la respuesta inflamatoria en la glándula mamaria. Como se ha reportado previamente, TTP es fosforilada y consecuentemente inactivada por MK2, una proteína río abajo en la vía de p38, la cual es inducida en microambientes estresantes y activada por TNFα. Hemos detectado fosfo-p38 aumentada en células TTP-KD, lo cual además se correlaciona con una actividad de TTP significativamente reducida, medida a través de la transfección transitoria de una construcción que contiene el ADNc de luciferasa río arriba del 3'UTR de Tnfα. Además de la regulación positiva de fosfo-p38, tanto fosfo-ERK1/2 como fosfo-JNK1/2 están disminuidas en las células TTP-KD. Curiosamente, la inhibición farmacológica de p38 mediante el tratamiento de células TTP-KD con SB203580 redujo los niveles de CC3 y fosfo-p65. Además, el tratamiento de células TTP-KD con SB203580 también restaura la actividad de TTP y la autorrenovación en cultivo 3D. Se lograron efectos similares al agregar Etanercept, un receptor de TNFα soluble que se utiliza para tratar enfermedades inflamatorias. Para abordar cómo la deleción de TTP afecta el potencial de diferenciación de la glándula mamaria durante preñeces sucesivas, aprovechamos nuestros ratones bi-transgénicos WAP- Cre/TTPfl/fl. Se ha demostrado que el promotor WAP no solo es activo en el epitelio mamario durante la lactancia, sino también en las células progenitoras "inducidas por la preñez" (PI-MEC), que participan en el desarrollo ductal y alveolar durante la preñez y la lactancia. Después de dos preñeces, las hembras que carecen de TTP en las células WAP+ mostraron alvéolos dramáticamente subdesarrollados en comparación con las ratonas control, lo que destaca la relevancia de la TTP en la preservación de las células progenitoras mamarias. Además, las glándulas lactantes de WAP-Cre/TTPfl/fl multíparas mostraron niveles incrementados de CC3 y fosfo-p38 en comparación con las ratonas control, lo que presenta semejanza con la línea celular TTP-KD. En resumen, nuestros resultados indican que la expresión de TTP es necesaria para la supervivencia de las células progenitoras mamarias al prevenir eventos proinflamatorios espontáneos y asociados al estrés, que pueden inducir la muerte normal de las células madre mamarias. En las células tumorales mamarias, los mismos efectos, impulsados por la pérdida de TTP, pueden promover la progresión del cáncer de mama y un mal pronóstico para la paciente. Por lo tanto, encontrar estrategias para mantener TTP en niveles de expresión elevados en la glándula mamaria protegería el compartimento progenitor sano y, simultáneamente, evitaría la progresión de las células cancerosas transformadas (fórmula aproximada, revisar la misma en el original).
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TTP modifica decaimiento de sus transcriptos blanco, muchos de las cuales codifican para citoquinas proinflamatorias (TNFα, IL-6, LIF, CSF2, IL-10), pero también para oncoproteínas, como c-Myc, Ciclina D1, VEGF y metaloproteinasas, entre otras. De acuerdo con ello, los niveles de TTP están reducidos en diferentes tipos de tumores, incluido el cáncer de mama, respecto al tejido normal. Comprender la función fisiológica de TTP en la glándula mamaria adulta nos ayudaría a determinar cómo la reducción en su expresión podría facilitar el crecimiento tumoral. En este sentido, nuestro grupo ha demostrado que, en la glándula mamaria, la expresión de TTP está aumentada en ratones hembra durante la lactancia y este efecto puede ser imitado por el tratamiento con prolactina en cultivo celular. En ratones TTP knockout condicionales (MG-TTP KO) obtenidos cruzando ratones TTPfl/fl con animales transgénicos WAP-Cre, hemos determinado que la pérdida de TTP en la glándula mamaria durante la lactancia afecta la alimentación de las crías e induce una involución precoz. Para explorar los resultados de la deficiencia de TTP en etapas tempranas del desarrollo, trasplantamos tejido de glándula mamaria de ratones TTP-KO vírgenes en almohadillas de grasa depletadas de su propio epitelio correspondientes a hembras receptoras wild type (WT). Después de 10 semanas, las hembras trasplantadas con epitelio mamario TTP-KO mostraron una morfogénesis deficiente en comparación con los implantes mamarios control. Estos datos sugirieron un impacto de TTP en las células indiferenciadas que impulsan el desarrollo de la glándula mamaria. En esta Tesis probamos la hipótesis mencionada anteriormente en primer lugar a través de la generación y análisis de una línea celular con menor expresión de TTP (TTP-KD) producida por transfección estable de células epiteliales mamarias HC11 con shRNA específicos para el ARN de TTP. Elegimos esta línea celular porque poseen propiedades stem, similares a las células progenitoras mamarias in vivo. Curiosamente, las células TTP-KD mostraron una reducción en sus tasas de supervivencia, aumento de la apoptosis y niveles incrementados de proteínas pro-apoptóticas como la caspasa 3 clivada (CC3) y BAX. Fenotípicamente, las células TTP-KD revelaron una capacidad disminuida para formar mamosferas en cultivo 3D y repoblar las almohadillas de grasa clareadas de ratones hembra BALB/c vírgenes a 10 semanas post implantación. Estos resultados indican que la muerte celular observada podría haber tenido un impacto significativo en el compartimento de células progenitoras mamarias. Hemos encontrado que las células TTP-KD mostraron una elevada expresión de los mensajeros Il-6 y Tnfα, dos blancos conocidos de TTP que codifican para citoquinas inflamatorias. De forma acorde, estas células presentaron niveles aumentados de fosfo-STAT3 y fosfo-p65 o subunidad RelA de NF-κB, proteínas cuyas vías correspondientes son activadas por IL-6 y TNFα, respectivamente. Ambas vías de señalización están implicadas en la apoptosis y la respuesta inflamatoria en la glándula mamaria. Como se ha reportado previamente, TTP es fosforilada y consecuentemente inactivada por MK2, una proteína río abajo en la vía de p38, la cual es inducida en microambientes estresantes y activada por TNFα. Hemos detectado fosfo-p38 aumentada en células TTP-KD, lo cual además se correlaciona con una actividad de TTP significativamente reducida, medida a través de la transfección transitoria de una construcción que contiene el ADNc de luciferasa río arriba del 3'UTR de Tnfα. Además de la regulación positiva de fosfo-p38, tanto fosfo-ERK1/2 como fosfo-JNK1/2 están disminuidas en las células TTP-KD. Curiosamente, la inhibición farmacológica de p38 mediante el tratamiento de células TTP-KD con SB203580 redujo los niveles de CC3 y fosfo-p65. Además, el tratamiento de células TTP-KD con SB203580 también restaura la actividad de TTP y la autorrenovación en cultivo 3D. Se lograron efectos similares al agregar Etanercept, un receptor de TNFα soluble que se utiliza para tratar enfermedades inflamatorias. Para abordar cómo la deleción de TTP afecta el potencial de diferenciación de la glándula mamaria durante preñeces sucesivas, aprovechamos nuestros ratones bi-transgénicos WAP- Cre/TTPfl/fl. Se ha demostrado que el promotor WAP no solo es activo en el epitelio mamario durante la lactancia, sino también en las células progenitoras "inducidas por la preñez" (PI-MEC), que participan en el desarrollo ductal y alveolar durante la preñez y la lactancia. Después de dos preñeces, las hembras que carecen de TTP en las células WAP+ mostraron alvéolos dramáticamente subdesarrollados en comparación con las ratonas control, lo que destaca la relevancia de la TTP en la preservación de las células progenitoras mamarias. Además, las glándulas lactantes de WAP-Cre/TTPfl/fl multíparas mostraron niveles incrementados de CC3 y fosfo-p38 en comparación con las ratonas control, lo que presenta semejanza con la línea celular TTP-KD. En resumen, nuestros resultados indican que la expresión de TTP es necesaria para la supervivencia de las células progenitoras mamarias al prevenir eventos proinflamatorios espontáneos y asociados al estrés, que pueden inducir la muerte normal de las células madre mamarias. En las células tumorales mamarias, los mismos efectos, impulsados por la pérdida de TTP, pueden promover la progresión del cáncer de mama y un mal pronóstico para la paciente. Por lo tanto, encontrar estrategias para mantener TTP en niveles de expresión elevados en la glándula mamaria protegería el compartimento progenitor sano y, simultáneamente, evitaría la progresión de las células cancerosas transformadas (fórmula aproximada, revisar la misma en el original). The stability of messenger RNAs (mRNAs) is controlled by proteins that bind sequences enriched in adenine and uracil (AREs) in their 3 untranslated regions (3 UTR) called collectively AU-binding proteins (AUBPs). This Thesis is focused on the analysis of the biological role of one particular AUBP called Tristetraprolin (TTP) in the mammary gland. TTP alters the decay of targeted transcripts, many of them coding for pro-inflammatory cytokines (i.e. TNFα, IL-6, LIF, CSF2, IL-10), but also oncoproteins, as c-Myc, Cyclin D1, VEGF and metalloproteinases, among others. Accordingly, TTP is downregulated in different tumor types, including breast cancer. Understanding the physiological function of TTP in the adult mammary gland would help us to determine how its down regulation might facilitate tumor growth. In this regard, our group has demonstrated that, in the mammary gland, TTP expression is increased in female mice during lactation and this effect can be mimic by prolactin treatment in cell culture. In conditional TTP knockout mice (MG-TTP KO) obtained by crossing TTPfl/fl with WAP-Cre transgenic animals, we have determined that TTP loss in the mammary gland during lactation impairs pup feeding and induces early involution. To explore the outcomes of TTP deficiency in earlier developmental stages, we transplanted mammary gland tissue from virgin TTP-KO mice into cleared fat pads of wild type (WT) female recipients. After 10 weeks, mice transplanted with TTP-KO mammary epithelium displayed deficient branching morphogenesis compared to control WT mammary implants. This data suggested an impact of TTP on undifferentiated cells that fuel mammary gland development. In this Thesis we tested the above-mentioned hypothesis firstly through the generation and analysis of a TTP knockdown cell line (TTP-KD) produced by stable transfection of HC11 mammary epithelial cells with specific TTP-shRNA constructs. We chose this cell line because it displays stem-like properties, similar to mammary progenitor cells in vivo. Interestingly, TTP-KD cells exhibited impaired survival rates, increased apoptosis and augmented levels of pro-apoptotic proteins such as cleaved caspase 3 (CC3) and BAX. Phenotypically, TTP-KD cells revealed a decreased capacity to form mammospheres in 3D culture and to repopulate cleared fat pads of virgin BALB/c female mice after 10 weeks post-implantation. These results indicate that the observed cell death could have had a significant impact on the mammary progenitor cell compartment. We have found that TTP-KD cells displayed high expression of Il-6 and Tnfα mRNAs, two known targets of TTP that code for inflammatory cytokines. Accordingly, these cells presented increased levels of phospho-STAT3 and phospho-p65 or RelA NF-κB subunit, proteins whose corresponding pathways are activated by IL-6 and TNFα, respectively. To be noted, both are implicated in apoptosis and inflammatory response of mammary gland tissue. As it has been reported previously, TTP is phosphorylated and consequently inactivated by MK2, a protein down-stream of the p38 pathway, which is induced in stressful microenvironments and activated by TNFα. We have detected augmented phospho-p38 in TTP-KD cells, which correlates with a significantly reduced TTP activity, measured through transient transfection of a construct containing the luciferase cDNA upstream of Tnfα 3’UTR. Besides phospho-p38 upregulation, both phospho-ERK1/2 and phospho-JNK1/2 are decreased in TTP-KD cells. Interestingly, pharmacological inhibition of p38 by treatment of TTP-KD cells with SB 203580, reduced both CC3 and phospho-p65 levels. Furthermore, this treatment also restores TTP activity and self-renewal in 3D culture of TTP-KD cells. Similar effects were accomplished by adding Etanercept, a soluble TNFα receptor used for treating inflammatory diseases. To address how TTP deletion affects mammary gland differentiation potential during successive pregnancies, we took advantage of our bi-transgenic mice WAP-Cre/TTPfl/fl. It has been proved that WAP promoter is not only active in mammary epithelium during lactation, but also in “pregnancy-induced” progenitor cells (PI-MECs), which are involved in ductal and alveolar development during pregnancy and lactation. After two pregnancies, female mice lacking TTP in WAP+ cells showed dramatically underdeveloped alveoli compared to control mice, which highlights the relevance of TTP in the preservation of mammary progenitor cells. Moreover, lactating glands of multiparous WAP-Cre/TTPfl/fl had increased CC3 and phospho-p38 levels compared to control mice, which shows resemblance with the cultured TTP-KD cell lines. In summary, our results indicate that TTP expression is required for mammary progenitor cell survival by preventing spontaneous pro-inflammatory and stress-associated events, which can induce normal mammary stem cell death. In mammary tumor cells, the same effects, driven by TTP loss, may promote breast cancer progression and a bad prognosis for the patient. Therefore, finding strategies for maintaining TTP at high expression levels in the mammary gland would protect the healthy progenitor compartment and, simultaneously, prevent progression of transformed cancer cells (fórmula aproximada, revisar la misma en el original). Fil: Stedile, Micaela Nadia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 3 de junio 2022 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7201_Stedile

Relevancia de la expresión de Tristetraprolina (TTP) en el mantenimiento del compartimento progenitor del epitelio mamario

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