Estudio de las proteínas FKBPs de alto peso molecular como moduladoras de la acción biológica de NF-kB

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Se denominan FKBPs (por FK506 binding proteins) a una subfamilia de proteínas pertenecientes a la familia de las inmunofilinas (IMMs). Las FKBPs son capaces de unir al macrólido inmunosupresor FK506, y como toda IMM de la familia, también se caracterizan por presentar un dominio que posee actividad...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	De Leo, Sonia Alejandra
Formato:	Tesis Doctoral
Lenguaje:	Español
Publicado:	2018
Materias:	FKBP51 FKBP52 NF-κB PPLASA PPLASE
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6513_DeLeo
Aporte de:	Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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description	Se denominan FKBPs (por FK506 binding proteins) a una subfamilia de proteínas pertenecientes a la familia de las inmunofilinas (IMMs). Las FKBPs son capaces de unir al macrólido inmunosupresor FK506, y como toda IMM de la familia, también se caracterizan por presentar un dominio que posee actividad enzimática de peptidil-prolil (cis/trans) isomerasa (PPIasa). La actividad enzimática de PPIasa favorece su acción biológica de chaperona molecular sobre proteínas plegadas. Es decir, las IMMs pueden funcionar como interruptores moleculares y generar consecuentemente cambios en diferentes vías de señalización. Esta capacidad las convierte en posibles blancos farmacológicos para modular diversos procesos biológicos, y en objeto de estudios prometedores dentro del campo de las ciencias biológicas y biomédicas. La droga FK506, además de tener acción inmunosupresora, inhibe la actividad enzimática intrínseca de PPIasa de las FKBPs cuando se encuentra en asociación con el dominio PPIasa. Este dominio es característico de la familia de las IMMs, y aquellos miembros de alto peso molecular poseen motivos adicionales que les confieren funciones biológicas complementarias. Este trabajo de tesis doctoral se centra en el estudio de dos FKBPs de alto peso molecular, FKBP51 y FKBP52. Ambas IMMs, cuentan con repeticiones de secuencias tetratricopeptídicas repetidas en tándem (los dominios TPR) que les posibilitan interactuar con proteínas de choque térmico tales como la Heat-Shock Protein de 90-kDA, Hsp90, una chaperona que forma heterocomplejos multiméricos con una gran variedad de proteínas-cliente, muchas de ellas esenciales para vida. FKBP51 y FKBP52 fueron las primeras IMMs de su subfamilia en ser identificadas como moduladoras de los receptores de esteroides (RE). Nuestro laboratorio ha participado en el estudio y el esclarecimiento del mecanismo de regulación de los RE por proteínas FKBPs y Hsps. En tal sentido, FKBP51 y FKBP52 han sido reconocidas como necesarias para el control de la actividad los receptores de andrógenos (AR), estrógenos (ER), glucocorticoides (GR), progesterona (PR) y mineralocoriticoides (MR). A pesar de que FKBP51 y FKBP52 presentan una alta identidad de secuencia y similitud estructural, en general desempeñan roles antagónicos en la regulación de la acción biológica de los RE. FKBP52 es un regulador positivo de los RE; mientras que FKBP51 funciona como regulador negativo (con excepción de AR que es estimulado por ambas FKBPs por igual). El modelo general de activación de los RE indica que, en ausencia de hormona, el receptor se encuentra mayoritariamente en el citoplasma. El heterocomplejo del que participa está formando por las chaperonas Hsp90 y Hsp70, junto con proteínas co-chaperonas como FKBP51. En presencia de hormona, se desencadenan una serie de cambios en la composición del heterocomplejo, que involucran el intercambio de FKBP51 por FKBP52 en el sitio aceptor del dímero de Hsp90 unido a los RE. FKBP52 es reclutada por la unión del esteroide e interactúa con la proteína motora dineína, lo cual posibilita el transporte activo del heterocomplejo al núcleo y, en consecuencia, la regulación de la expresión genes de respuesta a hormonas esteroideas. Debido a que mutantes del factor proapoptótico p53 poseen una localización primariamente citoplasmática en células no estimuladas y se asocian a Hsp90, primero se planteó la posibilidad y luego se demostró que las mutantes de p53 son reguladas de manera análoga a los RE. El modelo de transporte propuesto por nuestro laboratorio para la activación de los RE y p53 nos llevó a pensar en la posibilidad de que otros factores de transcripción que presenten un requerimiento de relocalización subcelular equivalente como parte de su mecanismo de acción, podrían llegar a utilizar la misma maquinaria molecular asociada a las IMMs. Es así que, de forma análoga a los RE, el factor de transcripción NF-B se encuentra inactivo en el citoplasma y es trasportado en forma activa al núcleo por el complejo motor de dineína/dinactina, siendo por ende un candidato interesante para analizar. NF-B es un factor de transcripción dimérico que cumple un rol crítico en la regulación de la inflamación, inmunidad, proliferación celular, diferenciación, desarrollo y supervivencia. Su desregulación se encuentra asociada a patologías inflamatorias, enfermedades neurológicas, y principalmente, a tumores sólidos y neoplasias hematológicas. El dímero más abundante y activo de NF-B en mamíferos está formado por las subunidades RelA/p65 y p50. Dadas las evidencias arriba comentadas con los RE, por los experimentos preliminares que resultaron positivos, y la experiencia previa del laboratorio en el estudio de IMMs, nos planteamos la hipótesis de que FKBP51 y FKBP52 podrían regular la función biológica de NF-κB. Los hallazgos alcanzados a lo largo de esta tesis demostraron que FKBP52 tiene un efecto estimulante sobre la acción biológica de NF-κB. FKBP52 participa de diferentes hitos en la activación del factor de transcripción e interactúa con la subunidad p65. Asimismo, resultados obtenidos con mutantes puntuales de FKBP52 sin actividad enzimática y por inhibición farmacológica de la actividad PPIasa, han demostrado que la acción de FKBP52 sobre NF-κB es dependiente de su actividad enzimática, una regulación que se evidenció tanto en fibroblastos embrionarios como en células Jurkat de leucemia linfoblástica aguda. De forma análoga a lo descubierto para los RE, este trabajo contribuyó a demostrar que FKBP51 es un modulador negativo de NF-κB y que es capaz de interactuar con la subunidad p65, tanto en células Hek293T como en Jurkat. A diferencia de lo evidenciado para FKBP52, la actividad PPIasa de FKBP51 no participa de la regulación del factor de transcripción, sino la IMM en sí misma. En estudios previos del laboratorio, se había demostrado que FKBP51 es un nuevo factor mitocondrial con propiedades antiapoptóticas. En línea con esos antecedentes, los experimentos realizados en esta tesis demostraron que FKBP51 es un actor estimulante de la proliferación y la supervivencia celular. No obstante, en esta tesis también se demuestra que estos efectos podrían ser la consecuencia de la acción de las IMMs sobre otra familia de factores de transcripción como los de la familia E2F, los que actúan de manera coordinada con NF-κB regulando a genes involucrados en la progresión de ciclo celular y apoptosis. Los descubrimientos realizados en este trabajo doctoral proponen que la actividad PPIasa de FKBP52 podría ser un blanco farmacológico para inhibir la acción de NF-κB con un fin terapéutico en aquellas patologías donde la activación de este factor de transcripción se encuentre desregulada. Adicionalmente, se formula que FKBP51 muestra en general propiedades como agente pro-proliferativo y antiapoptótico.
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Esta capacidad las convierte en posibles blancos farmacológicos para modular diversos procesos biológicos, y en objeto de estudios prometedores dentro del campo de las ciencias biológicas y biomédicas. La droga FK506, además de tener acción inmunosupresora, inhibe la actividad enzimática intrínseca de PPIasa de las FKBPs cuando se encuentra en asociación con el dominio PPIasa. Este dominio es característico de la familia de las IMMs, y aquellos miembros de alto peso molecular poseen motivos adicionales que les confieren funciones biológicas complementarias. Este trabajo de tesis doctoral se centra en el estudio de dos FKBPs de alto peso molecular, FKBP51 y FKBP52. Ambas IMMs, cuentan con repeticiones de secuencias tetratricopeptídicas repetidas en tándem (los dominios TPR) que les posibilitan interactuar con proteínas de choque térmico tales como la Heat-Shock Protein de 90-kDA, Hsp90, una chaperona que forma heterocomplejos multiméricos con una gran variedad de proteínas-cliente, muchas de ellas esenciales para vida. FKBP51 y FKBP52 fueron las primeras IMMs de su subfamilia en ser identificadas como moduladoras de los receptores de esteroides (RE). Nuestro laboratorio ha participado en el estudio y el esclarecimiento del mecanismo de regulación de los RE por proteínas FKBPs y Hsps. En tal sentido, FKBP51 y FKBP52 han sido reconocidas como necesarias para el control de la actividad los receptores de andrógenos (AR), estrógenos (ER), glucocorticoides (GR), progesterona (PR) y mineralocoriticoides (MR). A pesar de que FKBP51 y FKBP52 presentan una alta identidad de secuencia y similitud estructural, en general desempeñan roles antagónicos en la regulación de la acción biológica de los RE. FKBP52 es un regulador positivo de los RE; mientras que FKBP51 funciona como regulador negativo (con excepción de AR que es estimulado por ambas FKBPs por igual). El modelo general de activación de los RE indica que, en ausencia de hormona, el receptor se encuentra mayoritariamente en el citoplasma. El heterocomplejo del que participa está formando por las chaperonas Hsp90 y Hsp70, junto con proteínas co-chaperonas como FKBP51. En presencia de hormona, se desencadenan una serie de cambios en la composición del heterocomplejo, que involucran el intercambio de FKBP51 por FKBP52 en el sitio aceptor del dímero de Hsp90 unido a los RE. FKBP52 es reclutada por la unión del esteroide e interactúa con la proteína motora dineína, lo cual posibilita el transporte activo del heterocomplejo al núcleo y, en consecuencia, la regulación de la expresión genes de respuesta a hormonas esteroideas. Debido a que mutantes del factor proapoptótico p53 poseen una localización primariamente citoplasmática en células no estimuladas y se asocian a Hsp90, primero se planteó la posibilidad y luego se demostró que las mutantes de p53 son reguladas de manera análoga a los RE. El modelo de transporte propuesto por nuestro laboratorio para la activación de los RE y p53 nos llevó a pensar en la posibilidad de que otros factores de transcripción que presenten un requerimiento de relocalización subcelular equivalente como parte de su mecanismo de acción, podrían llegar a utilizar la misma maquinaria molecular asociada a las IMMs. Es así que, de forma análoga a los RE, el factor de transcripción NF-B se encuentra inactivo en el citoplasma y es trasportado en forma activa al núcleo por el complejo motor de dineína/dinactina, siendo por ende un candidato interesante para analizar. NF-B es un factor de transcripción dimérico que cumple un rol crítico en la regulación de la inflamación, inmunidad, proliferación celular, diferenciación, desarrollo y supervivencia. Su desregulación se encuentra asociada a patologías inflamatorias, enfermedades neurológicas, y principalmente, a tumores sólidos y neoplasias hematológicas. El dímero más abundante y activo de NF-B en mamíferos está formado por las subunidades RelA/p65 y p50. Dadas las evidencias arriba comentadas con los RE, por los experimentos preliminares que resultaron positivos, y la experiencia previa del laboratorio en el estudio de IMMs, nos planteamos la hipótesis de que FKBP51 y FKBP52 podrían regular la función biológica de NF-κB. Los hallazgos alcanzados a lo largo de esta tesis demostraron que FKBP52 tiene un efecto estimulante sobre la acción biológica de NF-κB. FKBP52 participa de diferentes hitos en la activación del factor de transcripción e interactúa con la subunidad p65. Asimismo, resultados obtenidos con mutantes puntuales de FKBP52 sin actividad enzimática y por inhibición farmacológica de la actividad PPIasa, han demostrado que la acción de FKBP52 sobre NF-κB es dependiente de su actividad enzimática, una regulación que se evidenció tanto en fibroblastos embrionarios como en células Jurkat de leucemia linfoblástica aguda. De forma análoga a lo descubierto para los RE, este trabajo contribuyó a demostrar que FKBP51 es un modulador negativo de NF-κB y que es capaz de interactuar con la subunidad p65, tanto en células Hek293T como en Jurkat. A diferencia de lo evidenciado para FKBP52, la actividad PPIasa de FKBP51 no participa de la regulación del factor de transcripción, sino la IMM en sí misma. En estudios previos del laboratorio, se había demostrado que FKBP51 es un nuevo factor mitocondrial con propiedades antiapoptóticas. En línea con esos antecedentes, los experimentos realizados en esta tesis demostraron que FKBP51 es un actor estimulante de la proliferación y la supervivencia celular. No obstante, en esta tesis también se demuestra que estos efectos podrían ser la consecuencia de la acción de las IMMs sobre otra familia de factores de transcripción como los de la familia E2F, los que actúan de manera coordinada con NF-κB regulando a genes involucrados en la progresión de ciclo celular y apoptosis. Los descubrimientos realizados en este trabajo doctoral proponen que la actividad PPIasa de FKBP52 podría ser un blanco farmacológico para inhibir la acción de NF-κB con un fin terapéutico en aquellas patologías donde la activación de este factor de transcripción se encuentre desregulada. Adicionalmente, se formula que FKBP51 muestra en general propiedades como agente pro-proliferativo y antiapoptótico. FK506 binding proteins (FKBPs) belong to a group of immunophilins (IMMs) capable of binding the immunosuppressive macrolide FK506. IMMs are characterized for having peptidyl-prolyl (cis/trans) isomerase (PPIase) enzymatic activity. The enzymatic activity of PPIases allows IMMs to act as molecular chaperones of folded proteins. For this reason, IMMs can function as molecular switches and modify different signaling pathways. This ability transforms this family of proteins into possible pharmacological targets to alter various biological processes and a promising object of study for biological and biomedical sciences. Besides having immunosuppressant action, when FK506 is associated to FKBPs, it functions as a potent inhibitor of their intrinsic PPIase activity. High molecular weight FKBPs have at least one domain with the characteristic enzymatic PPIase activity of their family of proteins, and additional motifs that can grant them supplementary biological functions. This PhD thesis is focused on the study of two specific high molecular weight FKBPs, FKBP51 and FKBP52. Both IMMs, have tetratricopeptide domains (TPR), additional to their domain with enzymatic activity that confers them the ability to interact with heat shock proteins (Hsps). FKBP51 and FKBP52 have been the first proteins of their family to be identified as regulators of the biological action of steroid receptors (SR). Our laboratory has participated in the study and the enlightenment of the regulation of SR by FKBPs and Hsps. Thus, FKBP51 and FKBP52 have been recognized as necessary actors for the control of the activity of the androgen (AR), estrogen (ER), glucocorticoid (GR), progesterone (PR) and mineralocoriticoides (MR) receptors. In general, although FKBP51 and FKBP52 have high identity of sequence and structural similarity, they perform antagonist roles in the regulation of the SR action. While FKBP52 is a positive regulator of the SR, FKBP51 functions as a negative regulator (except for AR that is stimulated equally by both IMMs). The accepted model for the activation of de SR, indicates that in absence of hormone, the receptor forms an heterocomplex that is mostly located in the cytoplasm. The heterocomplex is formed by the chaperones Hsp90 and Hsp70, in association to co-chaperones like FKBP51. After the stimulation with hormone, several changes in the complex composition are triggered that involve the exchange of FKBP51 by FKBP52. FKBP52 interacts with the motor protein dynein, thus allowing the active transport of the SR to the nucleus and the regulation of gene expression by steroid hormones. The proposed model by our laboratory for the activation of the SR lead to the idea that it could be possible that other transcription factors showing a similar subcellular translocation process, may use the same molecular mechanism as the SR. Analogously, to the SR, the transcription factor NF-κB is inactive in the cytoplasm and is actively transported to the nucleus by the motor complex dynein/dynactin. NF-κB is a dimeric transcription factor that has a critical role in the regulation of inflammation, immunity, cellular proliferation, differentiation, development and survival. Its deregulation is associated to inflammatory pathologies, neurological diseases, and mainly, solid tumors and hematological malignancies. The most abundant and active dimer of NF-κB in mammals is formed by the subunits RelA/p65 and p50. Altogether, the known evidences and the previous experience of the laboratory in the study of IMMs lead to propose the hypothesis of this PhD thesis that postulates that FKBP51 and FKBP52 regulate the biological action of NF-κB. The findings reached throughout this thesis demonstrate that FKBP52 has a positive effect over the biological action of NF-κB. This IMM participates in different hallmarks in the activation of the transcription factor, and it interacts with the subunit p65. Likewise, the results obtained with point mutants of FKBP52 without enzymatic activity and with the pharmacological inhibition of the PPIase activity, have demonstrated that the action of FKBP52 on NF-κB depends on its enzymatic activity. Most of these results also suggest that this regulation is present in the two human cell lines used in this work, Hek293T (embryonic fibroblasts) and Jurkat (acute T cell leukemia). Analogously to that discovered for the SR, this work has contributed to demonstrate that FKBP51 is a negative modulator of NF-κB in Hek293T cells and is capable of interacting with p65 subunit, both in Hek293T cells and Jurkat. Besides the findings made for FKBP52, the PPIase activity of FKBP51 does not participate in the regulation of the transcription factor. The experiments performed also showed that the IMM FKBP51 is a stimulating factor of cellular proliferation and survival. These effects could be a consequence of the findings made in this thesis about another family of transcription factors that regulate cell cycle progression and apoptosis in coordinate fashion with NF-κB, the family E2F. The discoveries made in this PhD work propose that the PPIase enzymatic activity of FKBP52 could be a new pharmacological target for the inhibition of NF-κB with a therapeutic goal in those pathologies where this transcription factor is deregulated, especially in hematological neoplasms. Additionally, it is postulated that FKBP51 might be pro-proliferative and antiapoptotic agent. Fil: De Leo, Sonia Alejandra. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 2018 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6513_DeLeo

Estudio de las proteínas FKBPs de alto peso molecular como moduladoras de la acción biológica de NF-kB

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