Mecanismos involucrados en la actividad oncogénica de la proteína R-spondin3 en la glándula mamaria

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Los genes R-spondin (Rspo) codifican para una familia de proteínas de secreción quemodulan las vías de señalización Wnt y están involucradas en múltiples procesos normales ypatológicos, de desarrollo y diferenciacion. Nuestro grupo determinó que particularmente Rspo3, aparece frecuentemente mutado y...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Tocci, Johanna Melisa
Formato: Tesis Doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2016
Materias:
RSPO3
GLANDULA MAMARIA
CANCER DE MAMA
SEÑALIZACION-WNT
MAMMARY GLAND
BREAST CANCER
WNT SIGNALING
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5971_Tocci
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description Los genes R-spondin (Rspo) codifican para una familia de proteínas de secreción quemodulan las vías de señalización Wnt y están involucradas en múltiples procesos normales ypatológicos, de desarrollo y diferenciacion. Nuestro grupo determinó que particularmente Rspo3, aparece frecuentemente mutado y sobre-expresado en tumores inducidos por el virus deltumor mamario murino (MMTV), induciendo la transformación de células mamarias. Estosresultados también fueron corroborados posteriormente por otro grupo de trabajo. En el marco de esta tesis doctoral, demostramos que Rspo3 puede ser expresado porcélulas mamarias, no infectadas por MMTV, particularmente en aquellas que presentanmarcadores basales. De hecho, líneas tumorales mamarias que no expresan receptoreshormonales y poseen un fenotipo altamente metastásico son las que expresan niveles más altosde este gen. A continuación, nos propusimos determinar si Rspo3 se expresa en la glándulamamaria murina normal. Para ello, a partir de tejido de hembras vírgenes de la cepa C57B/L6, sesepararon las diferentes poblaciones celulares mediante citometría de flujo, y por RT-PCRcuantitativa se pudo determinar que la subpoblación basal enriquecida en células stem (Lin- /CD24+/CD29hi) expresa Rspo3, mientras que este ARNm no fue detectado en la subpoblaciónluminal. Al evaluar el efecto de RSPO3 sobre la línea epitelial mamaria no-tumoral NMuMG,hallamos que esta proteína favorecía características celulares asociadas a la transición epiteliomesenquimal,como la reducción en los niveles de E-cadherina y el incremento en la expresiónde Fibronectina, así como cambios morfológicos característicos de este proceso. Para investigar las consecuencias de la disminución de la expresión endógena de Rspo3 enlas células tumorales mamarias, se transfectó de manera estable células de la línea murina SCg6con diferentes secuencias de shRNA específicos para Rspo3. En aquellos clones en los que severificó una importante disminución en la expresión de dicha proteína se observó, por análisis de RT-PCR cuantitativa e inmunofluorescencia, una reducción en los niveles de marcadores basalescomo Vimentina. También, pudimos determinar en dichos clones la inhibición de la capacidadmigratoria de estas células así como la reducción en los niveles de actividad nuclear de β-catenina, lo que sugiere que Rspo3 estaría participando a través de la activación de la víacanónica de Wnt. Finalmente, se inocularon células de la línea SCg6 con Rspo3 efectivamente silenciado enlas glándulas mamarias o subcutáneamente y se evaluó la capacidad tumorigénica de lasmismas. Hallamos que estos clones no generaban tumores o lo hacían con una latencia mayorque las células SCg6 parentales. En conjunto, estos resultados demuestran que Rspo3 es relevante para el mantenimientode la capacidad tumorigénica de las células mamarias y sugieren que participaría en elmantenimiento del fenotipo basal tanto de células mamarias normales como tumorales.
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En el marco de esta tesis doctoral, demostramos que Rspo3 puede ser expresado porcélulas mamarias, no infectadas por MMTV, particularmente en aquellas que presentanmarcadores basales. De hecho, líneas tumorales mamarias que no expresan receptoreshormonales y poseen un fenotipo altamente metastásico son las que expresan niveles más altosde este gen. A continuación, nos propusimos determinar si Rspo3 se expresa en la glándulamamaria murina normal. Para ello, a partir de tejido de hembras vírgenes de la cepa C57B/L6, sesepararon las diferentes poblaciones celulares mediante citometría de flujo, y por RT-PCRcuantitativa se pudo determinar que la subpoblación basal enriquecida en células stem (Lin- /CD24+/CD29hi) expresa Rspo3, mientras que este ARNm no fue detectado en la subpoblaciónluminal. Al evaluar el efecto de RSPO3 sobre la línea epitelial mamaria no-tumoral NMuMG,hallamos que esta proteína favorecía características celulares asociadas a la transición epiteliomesenquimal,como la reducción en los niveles de E-cadherina y el incremento en la expresiónde Fibronectina, así como cambios morfológicos característicos de este proceso. Para investigar las consecuencias de la disminución de la expresión endógena de Rspo3 enlas células tumorales mamarias, se transfectó de manera estable células de la línea murina SCg6con diferentes secuencias de shRNA específicos para Rspo3. En aquellos clones en los que severificó una importante disminución en la expresión de dicha proteína se observó, por análisis de RT-PCR cuantitativa e inmunofluorescencia, una reducción en los niveles de marcadores basalescomo Vimentina. También, pudimos determinar en dichos clones la inhibición de la capacidadmigratoria de estas células así como la reducción en los niveles de actividad nuclear de β-catenina, lo que sugiere que Rspo3 estaría participando a través de la activación de la víacanónica de Wnt. Finalmente, se inocularon células de la línea SCg6 con Rspo3 efectivamente silenciado enlas glándulas mamarias o subcutáneamente y se evaluó la capacidad tumorigénica de lasmismas. Hallamos que estos clones no generaban tumores o lo hacían con una latencia mayorque las células SCg6 parentales. En conjunto, estos resultados demuestran que Rspo3 es relevante para el mantenimientode la capacidad tumorigénica de las células mamarias y sugieren que participaría en elmantenimiento del fenotipo basal tanto de células mamarias normales como tumorales. R-spondin genes encode for a family of secreted proteins that modulate Wnt signalingpathways. They have been involved in the embryonic development, tissue differentiation,diverse diseases and they have been postulated as potent stem cells grow factors. Our groupestablished that Rspo, particularly Rspo3, is frequently mutated and over-expressed in inducedtumors by the Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV) and its over-expression induces mammarycells transformation. These results also have been found later by another group. In this thesis, we demonstrated that Rspo3 can be expressed by mammary cells, whichexpress basal/mesenchymal markers, even in absence of MMTV infection. Particularly, cell lineswhich do not express hormonal receptors and have a highly metastatic phenotype, express highlevels of Rspo3. Then, we studied the expression of Rspo3 in the normal murine mammaryglands. Tissues from virgin females of C57B/L6 strain were obtained and the different mammarycell populations were isolated by flow cytometry. The results obtained by quantitative RT-PCRindicate that the basal stem- enriched subpopulation (Lin-/CD24+/CD29hi) expresses Rspo3 butnot the luminal cells. We evaluated the effect of Rspo3 in non-tumoral mammary epithelial cell line NMuMGand we found that RSPO3 promoted characteristics associated with epithelial-to-mesenchymaltransition favors, a reduction in the levels of the epithelial marker e-cadherin and an increase inthe basal/mesenchymal marker fibronectin, associated with a change in cell morphology. In order to analyze the effect of Rspo3 silencing, mammary tumor cell line SCg6 wasstably transfected with specific shRNA sequences against Rspo3. We observed a decrease in Vimentin expression by analysis of quantitative RT-PCR and immunofluorescence. Furthermore,we detected the inhibition of migration ability by "wound healing assay" and a decrease in β-catenin nuclear activity, suggesting that Rspo3 could be promoting canonical pathway activation. Finally, we studiedether the tumorigenic ability oh the SCg6-shRspo3 cell line in vivo byinjecting cells into the mammary glands or subcutaneously in mice. Tumor generation appearedlate or in some cases no tumors were found compared to control SCg6-shScrambled cellsinjected in mice. Taking together, these results demonstrate that Rspo3 is relevant in the maintenance ofmammary tumoral characteristics, and suggest that this protein could participate in themaintenance of basal phenotype in normal and oncogenic mammary cells. Fil: Tocci, Johanna Melisa. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 2016-03-22 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5971_Tocci

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