Diseño y aplicación de microscopías avanzadas para el estudio de problemas de mecanotransducción celular y nanoplasmónica

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El estudio de problemas que requieren resolución espacial y especificidad química, en condicionesfísico-químicas o biológicas altamente controladas, demanda el desarrollo de herramientasespecíficas, novedosas, versátiles y de plataforma abierta que permitan la libreelección y control de los parámetr...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Caldarola, Martín
Formato: Tesis Doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2015
Materias:
MICROSCOPIAS OPTICAS DE FLUORESCENCIA
MICROSCOPIA DE FUERZA ATOMICA
MECANOTRANSDUCCION CELULAR
NANO-ANTENAS
SOLITONES EN FIBRAS OPTICAS DE CRISTAL FOTONICO
OPTICAL FLUORESCENCE MICROSCOPY
ATOMIC FORCE MICROSCOPY
CELLULAR MECHANOTRANSDUCTION
NANOANTENNAS
SOLITONS IN PHOTONIC CRYSTAL FIBERS
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5716_Caldarola
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description El estudio de problemas que requieren resolución espacial y especificidad química, en condicionesfísico-químicas o biológicas altamente controladas, demanda el desarrollo de herramientasespecíficas, novedosas, versátiles y de plataforma abierta que permitan la libreelección y control de los parámetros relevantes al problema en cuestión. En esta Tesis sehan encarado problemas en campos diversos como son la biofísica y la nanofotónica, peroque utilizan una misma plataforma de microscopía avanzada, adaptada especialmente paracada aplicación. En el campo de la biofísica, se estudió la dinámica de formación y remodelado de adhesionesfocales (FA). Las FAs son complejos multiproteicos que sirven a la célula como puntosde anclaje en la matriz extracelular. Su proceso de formación consta de distintas etapas yescalas temporales que dependen sustancialmente de las fuerzas aplicadas a la célula. Parapoder estudiar y entender este complejo proceso, altamente dinámico, es necesario realizarmediciones precisas de las fuerzas involucradas y poder correlacionarlas con la respuestabioquímica de la célula. Se presenta una técnica que permite obtener información cuantitativade la respuesta de células vivas a estímulos mecánicos locales y con especificidadmolecular, basada en la combinación de un microscopio de fuerza atómica (AFM), con unmicroscopio óptico de fluorescencia. Con esta técnica se estudiaron proteínas citosólicaspresentes en las adhesiones focales, tales como vinculina, FAK y zixina. Se observó la formaciónde una adhesión focal naciente en el caso de la vinculina, se cuantificó el tiempo dereclutamiento para la FAK y se estudió la distribución espacial de la zixina en adhesionesfocales maduras. Estos resultados muestran la utilidad de este desarrollo para el estudiode procesos biofísicos complejos involucrados en la mecanotransducción celular. En el campo de la nanofotónica y en particular de la nanoplasmónica, las llamadas nanoantenasmetálicas han sido ampliamente utilizadas en los últimos años para intensificary confinar la luz en volúmenes muy pequeños. Sus diversas aplicaciones van desde el sensadomolecular hasta las microscopías de alta resolución. La intensificación local del campoelectromagnético se debe a la excitación resonante de los llamados plasmones superficialesen los metales nanoestructurados. Sin embargo, uno de los problemas fundamentales deeste esquema consiste en la altísima generación de calor en la nanoesacala, producida porla excitación resonante. La plataforma multifunción desarrollada en esta Tesis admite serutilizada en la configuración de microscopio confocal de doble haz, que permite el controlindependiente de la generación de calor en la nanoantena, producido por uno de esos haces. La mencionada configuración fue utilizada en dos problemas de nanoplasmónica relacionados: A) el desarrollo y prueba de principios de un nuevo esquema de sensado molecular,que utiliza como mecanismo de sensado el calentamiento plasmónico de nanocilindros deoro y la consecuente dependencia de la intensidad de fluorescencia con la temperatura. B) El desarrollo de un método de mapeo térmico de alta resolución basado en la disminuciónde la intensidad de fluorescencia de un film polimérico dopado con moléculas fluorescentesy depositado sobre la muestra a estudiar. Con este método se estudió y comparó eldesempeño de nanoantenas plasmónicas metálicas y semiconductoras, arrojando como resultadoque las semiconductoras alcanzan menores temperaturas que las metálicas. Estodemuestra que las nanoantenas semiconductoras podrían utilizarse en esquemas de sensadoultrasensible, como ser SERS, sin afectar la muestra por calentamiento. Finalmente, se construyó y caracterizó una fuente de luz solitónica sintonizable por potencia,basada en una fibra óptica de cristal fotónico (PCF), que sirve como fuente de luzalternativa para el microscopio confocal. Se mostró que el ancho de pulso de los solitonesse mantiene constante para todo el rango de sintonizabilidad (860-1200 nm) en un valor de 45 fs. También se muestra la robustez de esta fuente de luz ante variaciones del chirp delpulso de entrada. Las particulares características de esta fuente de luz, principalmente suamplia y rápida sintonizabilidad, abre diversas alternativas para el estudio de propiedadesfísico-químicas de materiales así como propiedades bioquímicas en sistemas biológicos. Palabras clave: Microscopías ópticas de fluorescencia. Microscopía de Fuerza Atómica. Mecanotransduccióncelular. Nano-antenas. Solitones en fibras ópticas de cristal fotónico.
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spelling todo:tesis_n5716_Caldarola2023-10-03T13:00:22Z Diseño y aplicación de microscopías avanzadas para el estudio de problemas de mecanotransducción celular y nanoplasmónica Design and application of advanced microscopies for problems in cellular mechanotransduction and nanoplasmonics Caldarola, Martín MICROSCOPIAS OPTICAS DE FLUORESCENCIA MICROSCOPIA DE FUERZA ATOMICA MECANOTRANSDUCCION CELULAR NANO-ANTENAS SOLITONES EN FIBRAS OPTICAS DE CRISTAL FOTONICO OPTICAL FLUORESCENCE MICROSCOPY ATOMIC FORCE MICROSCOPY CELLULAR MECHANOTRANSDUCTION NANOANTENNAS SOLITONS IN PHOTONIC CRYSTAL FIBERS El estudio de problemas que requieren resolución espacial y especificidad química, en condicionesfísico-químicas o biológicas altamente controladas, demanda el desarrollo de herramientasespecíficas, novedosas, versátiles y de plataforma abierta que permitan la libreelección y control de los parámetros relevantes al problema en cuestión. En esta Tesis sehan encarado problemas en campos diversos como son la biofísica y la nanofotónica, peroque utilizan una misma plataforma de microscopía avanzada, adaptada especialmente paracada aplicación. En el campo de la biofísica, se estudió la dinámica de formación y remodelado de adhesionesfocales (FA). Las FAs son complejos multiproteicos que sirven a la célula como puntosde anclaje en la matriz extracelular. Su proceso de formación consta de distintas etapas yescalas temporales que dependen sustancialmente de las fuerzas aplicadas a la célula. Parapoder estudiar y entender este complejo proceso, altamente dinámico, es necesario realizarmediciones precisas de las fuerzas involucradas y poder correlacionarlas con la respuestabioquímica de la célula. Se presenta una técnica que permite obtener información cuantitativade la respuesta de células vivas a estímulos mecánicos locales y con especificidadmolecular, basada en la combinación de un microscopio de fuerza atómica (AFM), con unmicroscopio óptico de fluorescencia. Con esta técnica se estudiaron proteínas citosólicaspresentes en las adhesiones focales, tales como vinculina, FAK y zixina. Se observó la formaciónde una adhesión focal naciente en el caso de la vinculina, se cuantificó el tiempo dereclutamiento para la FAK y se estudió la distribución espacial de la zixina en adhesionesfocales maduras. Estos resultados muestran la utilidad de este desarrollo para el estudiode procesos biofísicos complejos involucrados en la mecanotransducción celular. En el campo de la nanofotónica y en particular de la nanoplasmónica, las llamadas nanoantenasmetálicas han sido ampliamente utilizadas en los últimos años para intensificary confinar la luz en volúmenes muy pequeños. Sus diversas aplicaciones van desde el sensadomolecular hasta las microscopías de alta resolución. La intensificación local del campoelectromagnético se debe a la excitación resonante de los llamados plasmones superficialesen los metales nanoestructurados. Sin embargo, uno de los problemas fundamentales deeste esquema consiste en la altísima generación de calor en la nanoesacala, producida porla excitación resonante. La plataforma multifunción desarrollada en esta Tesis admite serutilizada en la configuración de microscopio confocal de doble haz, que permite el controlindependiente de la generación de calor en la nanoantena, producido por uno de esos haces. La mencionada configuración fue utilizada en dos problemas de nanoplasmónica relacionados: A) el desarrollo y prueba de principios de un nuevo esquema de sensado molecular,que utiliza como mecanismo de sensado el calentamiento plasmónico de nanocilindros deoro y la consecuente dependencia de la intensidad de fluorescencia con la temperatura. B) El desarrollo de un método de mapeo térmico de alta resolución basado en la disminuciónde la intensidad de fluorescencia de un film polimérico dopado con moléculas fluorescentesy depositado sobre la muestra a estudiar. Con este método se estudió y comparó eldesempeño de nanoantenas plasmónicas metálicas y semiconductoras, arrojando como resultadoque las semiconductoras alcanzan menores temperaturas que las metálicas. Estodemuestra que las nanoantenas semiconductoras podrían utilizarse en esquemas de sensadoultrasensible, como ser SERS, sin afectar la muestra por calentamiento. Finalmente, se construyó y caracterizó una fuente de luz solitónica sintonizable por potencia,basada en una fibra óptica de cristal fotónico (PCF), que sirve como fuente de luzalternativa para el microscopio confocal. Se mostró que el ancho de pulso de los solitonesse mantiene constante para todo el rango de sintonizabilidad (860-1200 nm) en un valor de 45 fs. También se muestra la robustez de esta fuente de luz ante variaciones del chirp delpulso de entrada. Las particulares características de esta fuente de luz, principalmente suamplia y rápida sintonizabilidad, abre diversas alternativas para el estudio de propiedadesfísico-químicas de materiales así como propiedades bioquímicas en sistemas biológicos. Palabras clave: Microscopías ópticas de fluorescencia. Microscopía de Fuerza Atómica. Mecanotransduccióncelular. Nano-antenas. Solitones en fibras ópticas de cristal fotónico. The study of problems that require both spatial resolution and chemical specificity demandsthe development of specific and adaptable tools for the relevant variables of each problem. In this thesis we have studied two problems from different fields such as biophysics andnanophotonics, using the same platform of advanced microscopy. In the biophysics field, we studied the dynamics of formation and remodeling of Focal Adhesions (FA). FAs are multiprotein complex the cell creates to anchor to the extra cellularmatrix. This adhesion process is a highly dynamic force-dependent process that evolves atseveral temporal scales. An understanding of this process requires precise measurementsof forces and its correlation with the biochemical responses in living cells. We present amethod that allows to access quantitatively information about live cell responses when acontrolled, local and specific mechanical stimulus is applied to live cells. This approachcombines atomic force microscopy (AFM) with fluorescence imaging. Using this combinedtechnique, we studied the recruitment of adhesion proteins such as vinculin, FAK and zyxintriggered by applying forces in the nN regime. We observed the development of a nascentadhesion site, which was evident from the accumulation of vinculin at the position wherethe force was applied. In addition, we quantified the recruitment time for FAK in the formationof a new adhesion site, and analyzed the zyxin spatial distribution remodeling inmature focal adhesion as a function of the applied force. We have demonstrated that thismethod is a useful tool for the study of a variety of complex biological processes involvedin cellular mechanotransduction. In nanophotonics and particularly in nanoplasmonics field, we studied metallic nanoantennas,which have recently been widely used to enhance and confine light in nanometricvolumes. Nanoantennas have been proved to be useful in a variety of applications thatrange from molecular sensing to high resolution microscopies. The local field enhancementis due to so called plasmonic resonances, produced by the collective oscillation of the conductingelectrons in metals. However, there is a fundamental problem with this scheme:metallic structures suffer from ohmic losses, leading heating of the structure and its localenvironment. The multipropose platform developed in this thesis includes a dual beamconfocal microscope, which allows the use of one laser to control the heat generation independentlyfrom the fluorescence excitation. This configuration was used in two relatednanopalsmonic problems: A) the development and proof of principles of a new molecularsensing scheme, based in the plasmonic heating of gold nanorods and its consequentdecrease in the fluorescence intensity. B) The development of a method of thermal mappingbased in the decrease of fluorescence intensity with increasing temperature, using apolimeric thin film with fluorophores embedded deposited on the samples. We comparedthe temperature increase in gold and silicon nanoantennas when they are illuminated by anear infrared laser and we show lower temperature increase in the semiconductor structures. This fact demonstrates that semiconductor nanoantennas, unlike the metallic, can beused in ultra-sensitive schemes such as SERS without heating the sample. In addition, we built and characterized a high-speed wavelength tunable photonic crystalfiber-based source, capable of generating tunable femtosecond solitons in the infraredregion. This unique light source can be used as an alternative excitation source for theconfocal configuration. Through measurements and numerical simulation, we show thatboth the pulsewidth and the spectral width of the output pulses remain nearly constantover the entire tuning range (860 to 1200 nm). We also show that this source is insensitiveto chip variations in the pump pulse, even in the case of heavily chirped pulses. Allthese remarkable properties open up diverse alternatives to study physical and chemicalproperties of materials as well as biochemical properties in biological systems. Key words: Optical fluorescence Microscopy. Atomic Force Microscopy. Cellular mechanotransduction. Nanoantennas. Solitons in pohtonic crystal fibers. Fil: Caldarola, Martín. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 2015 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5716_Caldarola

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