Infección persistente del virus Junín in vitro : perturbación del equilibrio virus-célula como estrategia de estudio del mecanismo involucrado en este tipo de infecciones

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El virus Junín (JUNV), agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina, pertenece a la familia Arenaviridae. Los virus pertenecientes a esta familia son capaces de causar infecciones persistentes en roedores, los cualesactúan como reservorios naturales, asegurándose así su evolución y perpetuac...

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Autor principal: Fernández Bell Fano, Pablo
Formato: Tesis Doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2014
Materias:
VIRUS JUNIN
PERSISTENCIA
MUTAGENESIS
CICLO CELULAR
APOPTOSIS
SHOCK TERMICO
JUNIN VIRUS
PERSISTENCE
CELL CYCLE
HEAT SHOCK
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5613_FernandezBellFano
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description El virus Junín (JUNV), agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina, pertenece a la familia Arenaviridae. Los virus pertenecientes a esta familia son capaces de causar infecciones persistentes en roedores, los cualesactúan como reservorios naturales, asegurándose así su evolución y perpetuación en la naturaleza. Asimismo,son capaces de multiplicar en una amplia variedad de cultivos celulares pudiendo desarrollar el estadio depersistencia en la mayoría de ellos. El objetivo de este trabajo fue determinar las diferencias existentes entreinfecciones agudas y persistentes en cultivos de células Vero frente a tratamientos que tienden adesestabilizar el equilibrio virus célula. A tal fin, mediante la infección experimental de células Vero con la cepa XJCl3, se obtuvo una línea celular persistentemente infectada con dicho virus, denominada V3, que se utilizócomo modelo de estudio. En los ensayos realizados con el agente mutagénico 5-fluoruracilo (5-FU) se observó que la susceptibilidad a lainhibición ejercida por esta droga sobre JUNV dependió del lapso transcurrido entre el momento de lainfección y el tratamiento, y de la m.o.i. utilizada sugiriendo que la proporción de células infectadas almomento de tratar definía la resistencia a la droga. En este sentido, las células V3 resultaron menos afectadaspor el 5-FU en comparación con las células infectadas y tratadas durante la etapa aguda. Por otro lado, el análisis del ciclo celular de células Vero mostró que la infección con JUNV generó alteracionesen la respuesta del cultivo frente a estímulos como la confluencia de las células de la monocapa y eltratamiento con agentes inductores de arresto del ciclo. Durante ensayos de transfección con proteínas viralesdicha alteración del ciclo fue asociada a la nucleoproteína viral N. Sin embargo, a pesar de la aparentemanipulación del ciclo celular por parte del virus no se pudo asociar alteraciones inducidas del ciclo, a unadisminución en el rendimiento viral. Teniendo en cuenta que los cultivos persistentemente infectados no presentan el efecto citopático (EC) típicode las infecciones agudas de este virus en células Vero, se evaluó en primer lugar la naturaleza de dichofenómeno. El estudio de distintos indicadores de apoptosis mostró que dicho evento seguía una cinéticasimilar a la desarrollada por el EC viral, observándose además un incremento en la expresión de p53 y en elclivaje de la caspasa 3. Cuando estos indicadores se analizaron en células V3, los valores encontradospresentaron valores similares a los de células Vero sin infectar. Por otro lado, al analizar la respuesta de los distintos cultivos frente a la inducción de apoptosis con staurosporina (STS) o luz ultravioleta (UV) los cultivospersistentemente infectados resultaron más resistentes que los cultivos infectados de forma aguda y lascélulas sin infectar frente a la apoptosis inducida por luz UV y todos se comportaron de manera similar frente ala STS. Este comportamiento sugiere que JUNV podría estar modulando negativamente la apoptosis durante lapersistencia de manera específica frente a ciertos estímulos aunque no frente a un inductor fuerte como la STS. La resistencia al estrés térmico también fue evaluada como un parámetro diferencial entre los distintos tiposde cultivos. En forma similar a lo que sucedió con el 5-FU el virus resultó más resistente al tratamiento concalor cuando éste se aplicó a tiempos de tratamiento p.i. tardíos y a mayores m.o.i.. La síntesis de HSP-70,principal efector de la respuesta celular al shock térmico, no se asoció temporalmente con la reducción de lostítulos virales. De manera similar a lo observado con la respuesta al shock térmico, el tratamiento con arsenitode sodio (Ars), inductor de estrés oxidativo, resultó menos efectivo cuanto mayor era la proporción de célulasinfectadas en los cultivos. El conjunto de resultados permite concluir que las características diferenciales presentadas por los cultivosinfectados en forma persistente serían adquiridas durante el transcurso de la infección, al menos en el caso dela resistencia a los inductores de: extinción viral (5-FU), estrés térmico y oxidativo (HS y Ars) y alteraciones delciclo. Esta estrategia estaría basada en la acumulación de suficiente cantidad de proteínas, en particular, lanucleoproteína N, a fin de controlar las respuestas a estrés, ya sea por intervención directa de dichas proteínaso a través de la modulación en la formación de gránulos de estrés citoplasmáticos y/o de cuerpos nuclearesasociados a la proteína de leucemia promielocítica.
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spelling todo:tesis_n5613_FernandezBellFano2023-10-03T12:59:05Z Infección persistente del virus Junín in vitro : perturbación del equilibrio virus-célula como estrategia de estudio del mecanismo involucrado en este tipo de infecciones In vitro Junín virus persistent infections: perturbation of the equilibrium between virus and cell as a strategy of study of the mechanisms involved in this type of infections Fernández Bell Fano, Pablo VIRUS JUNIN PERSISTENCIA MUTAGENESIS CICLO CELULAR APOPTOSIS SHOCK TERMICO JUNIN VIRUS PERSISTENCE MUTAGENESIS CELL CYCLE APOPTOSIS HEAT SHOCK El virus Junín (JUNV), agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina, pertenece a la familia Arenaviridae. Los virus pertenecientes a esta familia son capaces de causar infecciones persistentes en roedores, los cualesactúan como reservorios naturales, asegurándose así su evolución y perpetuación en la naturaleza. Asimismo,son capaces de multiplicar en una amplia variedad de cultivos celulares pudiendo desarrollar el estadio depersistencia en la mayoría de ellos. El objetivo de este trabajo fue determinar las diferencias existentes entreinfecciones agudas y persistentes en cultivos de células Vero frente a tratamientos que tienden adesestabilizar el equilibrio virus célula. A tal fin, mediante la infección experimental de células Vero con la cepa XJCl3, se obtuvo una línea celular persistentemente infectada con dicho virus, denominada V3, que se utilizócomo modelo de estudio. En los ensayos realizados con el agente mutagénico 5-fluoruracilo (5-FU) se observó que la susceptibilidad a lainhibición ejercida por esta droga sobre JUNV dependió del lapso transcurrido entre el momento de lainfección y el tratamiento, y de la m.o.i. utilizada sugiriendo que la proporción de células infectadas almomento de tratar definía la resistencia a la droga. En este sentido, las células V3 resultaron menos afectadaspor el 5-FU en comparación con las células infectadas y tratadas durante la etapa aguda. Por otro lado, el análisis del ciclo celular de células Vero mostró que la infección con JUNV generó alteracionesen la respuesta del cultivo frente a estímulos como la confluencia de las células de la monocapa y eltratamiento con agentes inductores de arresto del ciclo. Durante ensayos de transfección con proteínas viralesdicha alteración del ciclo fue asociada a la nucleoproteína viral N. Sin embargo, a pesar de la aparentemanipulación del ciclo celular por parte del virus no se pudo asociar alteraciones inducidas del ciclo, a unadisminución en el rendimiento viral. Teniendo en cuenta que los cultivos persistentemente infectados no presentan el efecto citopático (EC) típicode las infecciones agudas de este virus en células Vero, se evaluó en primer lugar la naturaleza de dichofenómeno. El estudio de distintos indicadores de apoptosis mostró que dicho evento seguía una cinéticasimilar a la desarrollada por el EC viral, observándose además un incremento en la expresión de p53 y en elclivaje de la caspasa 3. Cuando estos indicadores se analizaron en células V3, los valores encontradospresentaron valores similares a los de células Vero sin infectar. Por otro lado, al analizar la respuesta de los distintos cultivos frente a la inducción de apoptosis con staurosporina (STS) o luz ultravioleta (UV) los cultivospersistentemente infectados resultaron más resistentes que los cultivos infectados de forma aguda y lascélulas sin infectar frente a la apoptosis inducida por luz UV y todos se comportaron de manera similar frente ala STS. Este comportamiento sugiere que JUNV podría estar modulando negativamente la apoptosis durante lapersistencia de manera específica frente a ciertos estímulos aunque no frente a un inductor fuerte como la STS. La resistencia al estrés térmico también fue evaluada como un parámetro diferencial entre los distintos tiposde cultivos. En forma similar a lo que sucedió con el 5-FU el virus resultó más resistente al tratamiento concalor cuando éste se aplicó a tiempos de tratamiento p.i. tardíos y a mayores m.o.i.. La síntesis de HSP-70,principal efector de la respuesta celular al shock térmico, no se asoció temporalmente con la reducción de lostítulos virales. De manera similar a lo observado con la respuesta al shock térmico, el tratamiento con arsenitode sodio (Ars), inductor de estrés oxidativo, resultó menos efectivo cuanto mayor era la proporción de célulasinfectadas en los cultivos. El conjunto de resultados permite concluir que las características diferenciales presentadas por los cultivosinfectados en forma persistente serían adquiridas durante el transcurso de la infección, al menos en el caso dela resistencia a los inductores de: extinción viral (5-FU), estrés térmico y oxidativo (HS y Ars) y alteraciones delciclo. Esta estrategia estaría basada en la acumulación de suficiente cantidad de proteínas, en particular, lanucleoproteína N, a fin de controlar las respuestas a estrés, ya sea por intervención directa de dichas proteínaso a través de la modulación en la formación de gránulos de estrés citoplasmáticos y/o de cuerpos nuclearesasociados a la proteína de leucemia promielocítica. Junín virus (JUNV), the etiological agent of the Argentine Hemorrhagic Fever, belongs to the family Arenaviridae. Viruses belonging to this family are able to cause persistent infections in rodents, which act asnatural reservoirs, thus ensuring their evolution and perpetuation in nature. They are also able to multiply in awide variety of cell cultures having the capacity to develop persistence stage in most of them. The aim of thisstudy was to determine the differences in the response of acute and persistent infection of JUNV in Vero cellsto treatments that tend to disrupt the virus-cell equilibrium typical of the latter. To this end, we obtained a cellline persistently infected with the virus, called V3, through experimental infection of Vero cells with JUNV XJCl3 strain, which was used as a study model. Studies performed with the mutagenic agent 5-fluorouracil (5-FU) showed that susceptibility to inhibitionexerted by this drug on JUNV depended on the time elapsed between the time of infection and treatment, andthe m.o.i. used suggesting that the proportion of infected cells when treatment was applied defined thedegree of drug resistance. In this sense, the V3 cells were less affected by the 5-FU compared with treatedacutely infected cells. On the other hand, cell cycle profile of Vero cells infected with JUNV was different from acutely and noninfected cultures when subjected to conditions of cell cycle arrest. During transfection assays with plasmidsexpressing viral proteins, alterations of cell cycle, similar to those observed by infection, were associated withthe expression of the viral nucleocapsid N. However, despite the apparent alteration of cell cycle by the virus,no effect on viral replication could be associated with experimentally induced cell cycle alterations. Given that persistently infected cultures do not exhibit the typical cytopathic effect (CE) characteristic ofacutely infected Vero cells, the nature of this phenomenon was evaluated in first place. The study of variousindicators of apoptosis showed that this event followed similar kinetics as the CE that took place in infectedcells, with a concomitant increase in expression of p53 and cleavage of caspase-3. By contrast, the level ofthese apoptotic markers was similar for V3 and non-infected Vero cells. On the other hand, the response totwo apoptosis inducers, staurosporine (STS) and UV radiation revealed that persistently infected culturesshowed resistance to the latter whereas acutely, persistently and non-infected cells were equally susceptibleto STS. This is probably due to the fact that induction of apoptosis by UV treatment is carried out by a specificcellular pathway that might be modulated by the virus during persistence, while STS exerts its effect as a multitargetagent. The tests performed to determine the effect of HSP-70 induction on JUNV replication of the virus showed thatthis protein was not involved in the reduction of viral titer. Similar to the results obtained with 5-FU, the viruswas more resistant at late p.i. treatment times and high m.o.i.. Both heat-shock and treatment with theoxidative stress-inducing drug sodium arsenite (Ars) were effective in reducing viral titers. Further analysis ofthe activity of heat shock showed that its range of action embraced 2 steps of the viral cycle: the processesleading to the budding of virions and protein translation. Heat-shock response was also evaluated as a differential parameter among the different types of infected andnon-infected cell cultures. Similarly to the conclusions withdrawn with 5-FU, JUNV infections were moreresistant to heat-shock when treatment was applied late during infection or when high m.o.i. were employed. Synthesis of HSP-70, main effector of heat-shock response, could not be associated to the decrease in virustiter observed in heat-shocked cultures. Also, arsenite, an oxidative stress inducer, diminished viral replication. The degree of arsenite inhibition was dependent of the proportion of infected cells in the monolayer. Altogether, the results allow to conclude that the differential characteristics between JUNV acutely andpersistently infected Vero cells would be acquired during the course of infection, at least for the resistance to 5-FU, heat shock, oxidative stress and altered cell cycle. This strategy would be based on the premise ofaccumulation of viral proteins, particularly the nucleoprotein, in order to control cellular response to stress,either directly or by modulating stress granules formation and/or nuclear bodies associated to thepromielocytic leukemia protein. Fil: Fernández Bell Fano, Pablo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 2014-07 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5613_FernandezBellFano

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