La proteína no-estructural NS1 exclusiva del virus respiratorio sincicial : mecanismo de plegamiento y ensamblado quasi-espontáneo de oligómeros esféricos estables

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Los Paramixovirus son una familia diversa de virus ARN de cadena negativa pertenecientes alorden de los Mononegavirales. Estos virus han evolucionado diversas estrategias para bloquearlos mecanismos de respuesta inmune innata del huésped en el curso de un proceso infeccioso. Elvirus respiratorio sin...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor principal: Pretel, Miguel Esteban
Formato: Tesis Doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2014
Materias:
VIRUS RESPIRATORIO SINCICIAL
NS1
PLEGAMIENTO
OLIGOMEROS ESFERICOS
AMILOIDES
RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS
FOLDING
SPHERICAL OLIGOMERS
AMYLOIDS
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5494_Pretel
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description Los Paramixovirus son una familia diversa de virus ARN de cadena negativa pertenecientes alorden de los Mononegavirales. Estos virus han evolucionado diversas estrategias para bloquearlos mecanismos de respuesta inmune innata del huésped en el curso de un proceso infeccioso. Elvirus respiratorio sincicial (RSV) es la mayor causa de enfermedad pediátrica en el mundo. Estevirus, contiene a dos proteínas no estructurales (NS1/NS2) la cuáles sólo se encuentran en RSVy no muestran homología con ninguna otra proteína. NS1 y NS2 han sido postuladas como losprincipales factores de virulencia de RSV, interviniendo en el bloqueo de la respuesta inmuneinducida por el virus. Se han identificado múltiple blancos celulares que interactúan con NS1 y NS2, principalmente relacionados a las vías de inducción y respuesta a interferón. En estetrabajo de tesis, se realizó el estudio de la conformación de NS1 en solución, haciendo uso demétodos bioquímicos y biofísicos para su estudio. Como primera medida, se desarrolló unprotocolo de expresión y purificación que permitió obtener un rendimiento de 10 mg/L deproteína homogénea en solución. Se determinó que NS1 es un monómero plegado globular, elcual contiene regiones flexibles que presentan intercambio conformacional. La temperaturainduce cambios estructurales que llevan a la formación de oligómeros esféricos solubles (NS1SOs) los cuales presentan propiedades amiloides. Se analizó la cinética de formación deestos oligómeros, a partir de lo cual se propone un modelo de ensamblado identificando eventosclave para el proceso. Por otro lado, estudios de plegamiento al equilibrio indican que NS1 sedespliega cooperativamente en un proceso reversible de dos estados (Nativo – Desplegado),mientras que NS1SOs primero se disocia a monómeros nativos y luego se despliega. Estudios decinética de plegado de NS1, indican que mientras que el desplegado de la proteína esrelativamente sencillo, su plegado es complejo y limitado cinéticamente por la presencia demúltiples intermediarios, compatible con heterogeneidad cis/trans de prolinas en el estadodesplegado. En resumen, en el presente trabajo se describe la diversidad conformacional de laproteína NS1. Esta proteína se encuentra en cuasi-equilibrio con oligómeros esféricos y estables,los cuales se forman en condiciones compatibles con un entorno celular. Estos estudiosconstituyen los primeros en analizar los equilibrios conformacionales para esta proteína ypodrían explicar sus múltiples blancos y funciones reportadas.
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Estevirus, contiene a dos proteínas no estructurales (NS1/NS2) la cuáles sólo se encuentran en RSVy no muestran homología con ninguna otra proteína. NS1 y NS2 han sido postuladas como losprincipales factores de virulencia de RSV, interviniendo en el bloqueo de la respuesta inmuneinducida por el virus. Se han identificado múltiple blancos celulares que interactúan con NS1 y NS2, principalmente relacionados a las vías de inducción y respuesta a interferón. En estetrabajo de tesis, se realizó el estudio de la conformación de NS1 en solución, haciendo uso demétodos bioquímicos y biofísicos para su estudio. Como primera medida, se desarrolló unprotocolo de expresión y purificación que permitió obtener un rendimiento de 10 mg/L deproteína homogénea en solución. Se determinó que NS1 es un monómero plegado globular, elcual contiene regiones flexibles que presentan intercambio conformacional. La temperaturainduce cambios estructurales que llevan a la formación de oligómeros esféricos solubles (NS1SOs) los cuales presentan propiedades amiloides. Se analizó la cinética de formación deestos oligómeros, a partir de lo cual se propone un modelo de ensamblado identificando eventosclave para el proceso. Por otro lado, estudios de plegamiento al equilibrio indican que NS1 sedespliega cooperativamente en un proceso reversible de dos estados (Nativo – Desplegado),mientras que NS1SOs primero se disocia a monómeros nativos y luego se despliega. Estudios decinética de plegado de NS1, indican que mientras que el desplegado de la proteína esrelativamente sencillo, su plegado es complejo y limitado cinéticamente por la presencia demúltiples intermediarios, compatible con heterogeneidad cis/trans de prolinas en el estadodesplegado. En resumen, en el presente trabajo se describe la diversidad conformacional de laproteína NS1. Esta proteína se encuentra en cuasi-equilibrio con oligómeros esféricos y estables,los cuales se forman en condiciones compatibles con un entorno celular. Estos estudiosconstituyen los primeros en analizar los equilibrios conformacionales para esta proteína ypodrían explicar sus múltiples blancos y funciones reportadas. Paramixoviruses are a diverse family of negative-strand RNA viruses that belong to the order of Mononegavirales. These viruses evolved different strategies in order to block the host innateimmunity during infection. Respiratory Syncytial Virus (RSV) is the major infectious agent thatcauses pediatric respiratory disease worldwide. RSV contains the two non structural proteins (NS1 and NS2) which are unique to RSV and show no homology to any other protein in relationto its primary structure. These two proteins were postulated as the RSV major virulence factors,and play a central role in blocking the immune response induced by the virus. Multiple cellulartargets have been reported for NS1 and NS2, mainly related to the interferon pathways. In thisthesis, we studied the NS1 conformation in solution, making use of different biochemical andbiophysical techniques. First, we developed an expression and purification protocol whichallowed us to obtain 10 mg/L of highly purified protein. We observed that NS1 is a folded andglobular monomer which contains some flexible regions subject to slow conformationalmotions. Temperature induces a cooperative structural change leading to soluble and sphericaloligomers (NS1SOs) with amyloid properties. We performed a kinetic analysis which allowedus to propose a model in relation to oligomer formation, identifying key events of the process. Equilibrium folding studies revealed that NS1 unfolds following a two-state reaction, in a fullyreversible process, whereas NS1SOs first dissociates into native monomers and them unfolds. On the other hand, kinetic folding studies indicated that although unfolding is a rather simpleprocess, refolding is complex, limited by multiple kinetic intermediates, compatible with prolylcis/trans heterogeneity in the unfolded state. In summary, the present work describes theconformational diversity of the NS1 protein. NS1 exists in quasi-equilibrium with stable andspherical oligomers, which are formed in conditions compatible with a cellular environment. This work represents the first study in relation to conformational equilibria of the NS1 proteinand may explain its multiple binding partners and functions reported. Fil: Pretel, Miguel Esteban. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 2014 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5494_Pretel

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