Mecanismos moleculares involucrados en la señalización celular de la hormona CRH en el sistema nervioso central

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La hormona liberadora de corticotrofina (CRH) juega un rol clave en la coordinación de la respuesta neuroendocrina, autonómica, inmune y comportamental frente al estrés. Se ha visto que el receptor de CRH de tipo 1 (CRHR1) estimulado por CRH activa ERK1/2 en función del contexto celular. En trabajos...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Bonfiglio, Juan José
Formato: Tesis Doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2013
Materias:
CRH
MAPKS
ERK1/2
B-RAF
CAMP
PROTEOMICA
SS-ARRESTINAS
PROTEMICS
SS-ARRESTINS
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5306_Bonfiglio
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description La hormona liberadora de corticotrofina (CRH) juega un rol clave en la coordinación de la respuesta neuroendocrina, autonómica, inmune y comportamental frente al estrés. Se ha visto que el receptor de CRH de tipo 1 (CRHR1) estimulado por CRH activa ERK1/2 en función del contexto celular. En trabajos previos realizados en nuestro laboratorio, demostramos que CRH activa ERK1/2 en zonas límbicas del cerebro de ratón (hipocampo y amígdala basolateral). ERK1/2 es un mediador esencial de los procesos fisiológicos del hipocampo, incluyendo el comportamiento emocional, la plasticidad sináptica, el aprendizaje y la memoria. Para dilucidar los mecanismos moleculares mediante los cuales CRH activa ERK1/2 en neuronas del hipocampo, utilizamos una línea celular ampliamente empleada como modelo neuronal hipocampal, las HT22. En este trabajo demostramos por primera vez que la activación de ERK1/2 en respuesta a CRH es de tipo bifásica, con una primera fase mediada por cAMP y B-Raf, y una segunda fase que depende fundamentalmente de la proteína β-arrestina2 y de la internalización de CRHR1. Teniendo en cuenta el hecho de que las interacciones biomoleculares juegan un papel crucial en la mayoría de los procesos celulares, decidimos analizar el interactoma de B-Raf mediante estudios de espectrometría de masa. En una primera etapa describimos el interactoma de B-Raf en células en estado basal. Habiendo encontrado interactores de esta MAPKKK que podrían ser componentes clave en la regulación de la señalización vía B-Raf- MEK1/2-ERK1/2, nos propusimos, en una segunda etapa, estudiar complejos proteicos asociados a B-Raf después de la activación de CRHR1 a tiempos cortos, donde B-Raf juega un rol clave. Usando herramientas farmacológicas y moleculares, evaluamos el impacto funcional de algunas de las proteínas identificadas en asociación a B-Raf en dichos tiempos cortos. Nuestros resultados indican que las proteínas 14-3-3, PKA, y Rap1, son esenciales para la etapa temprana de activación de ERK1/2 inducida por CRH, mientras que dinamina y vimentina son necesarias para la fase dependiente de la internalización de CRHR1. Demostramos que ambas fases de pERK1/2 dependen de la entrada de calcio y se ven afectadas por la inhibición de la CaMKII. Por lo tanto, este trabajo describe la dinámica y la naturaleza bifásica de la activación de ERK1/2 río abajo CRHR1 en un contexto neuronal e identifica nuevos componentes críticos de la maquinaria de señalización de CRHR1 que controlan selectivamente, o bien la fase temprana, o bien la fase tardía de la activación de ERK1/2, proporcionando así nuevos posibles blancos terapéuticos para trastornos relacionados con el estrés.
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Para dilucidar los mecanismos moleculares mediante los cuales CRH activa ERK1/2 en neuronas del hipocampo, utilizamos una línea celular ampliamente empleada como modelo neuronal hipocampal, las HT22. En este trabajo demostramos por primera vez que la activación de ERK1/2 en respuesta a CRH es de tipo bifásica, con una primera fase mediada por cAMP y B-Raf, y una segunda fase que depende fundamentalmente de la proteína β-arrestina2 y de la internalización de CRHR1. Teniendo en cuenta el hecho de que las interacciones biomoleculares juegan un papel crucial en la mayoría de los procesos celulares, decidimos analizar el interactoma de B-Raf mediante estudios de espectrometría de masa. En una primera etapa describimos el interactoma de B-Raf en células en estado basal. Habiendo encontrado interactores de esta MAPKKK que podrían ser componentes clave en la regulación de la señalización vía B-Raf- MEK1/2-ERK1/2, nos propusimos, en una segunda etapa, estudiar complejos proteicos asociados a B-Raf después de la activación de CRHR1 a tiempos cortos, donde B-Raf juega un rol clave. Usando herramientas farmacológicas y moleculares, evaluamos el impacto funcional de algunas de las proteínas identificadas en asociación a B-Raf en dichos tiempos cortos. Nuestros resultados indican que las proteínas 14-3-3, PKA, y Rap1, son esenciales para la etapa temprana de activación de ERK1/2 inducida por CRH, mientras que dinamina y vimentina son necesarias para la fase dependiente de la internalización de CRHR1. Demostramos que ambas fases de pERK1/2 dependen de la entrada de calcio y se ven afectadas por la inhibición de la CaMKII. Por lo tanto, este trabajo describe la dinámica y la naturaleza bifásica de la activación de ERK1/2 río abajo CRHR1 en un contexto neuronal e identifica nuevos componentes críticos de la maquinaria de señalización de CRHR1 que controlan selectivamente, o bien la fase temprana, o bien la fase tardía de la activación de ERK1/2, proporcionando así nuevos posibles blancos terapéuticos para trastornos relacionados con el estrés. Corticotropin-releasing hormone (CRH) is a key regulator of neuroendocrine, immune, autonomic and behavioral response to stress. CRH-stimulated CRH receptor 1 (CRHR1) activates ERK1/2 depending on intracellular context. In a previous work from our laboratory, we demonstrated that CRH activates ERK1/2 in limbic areas of the mouse brain (hippocampus and basolateral amygdala). ERK1/2 is an essential mediator of hippocampal physiological processes including emotional behavior, synaptic plasticity, learning and memory. To elucidate the molecular mechanisms by which CRH activates ERK1/2 in hippocampal neurons, we employed the mouse hippocampal cell line HT22, widely used as a model of hippocampal neuronal cells. We document for the first time that ERK1/2 activation in response to CRH is biphasic, involving a first cAMP and B-Raf-dependent early phase, and a second phase that critically depends on CRHR1 internalization and β-arrestin2. Considering the fact that biomolecular interactions play a crucial role in many cellular processes, we decided to analyze the B-Raf interactome by means of mass spectrometry analysis. In a first step, we described the B-Raf interactome in non-stimulated cells. Having found interactors of this MAPKKK which could be key components in the regulation of the B-Raf-MEK1/2-ERK1/2 signaling pathway, we decided, in a second stage, to study the B-Raf partners after CRHR1 activation at short times, where B-Raf plays a key role. Using molecular and pharmacological tools, the functional impact of selected B-Raf partners in CRH-dependent ERK1/2 activation was dissected. Our results indicate that 14-3-3 proteins, PKA, and Rap1, are essential for early CRHinduced ERK1/2 activation, whereas dynamin and vimentin are required for CRHR1 internalization-dependent phase. Both phases of ERK1/2 activation depend on calcium influx and are affected by CaMKII inactivation. Thus, this report describes the dynamics and biphasic nature of ERK1/2 activation downstream neuronal CRHR1 and identifies several new critical components of the CRHR1 signaling machinery that selectively controls the early and late phases of ERK1/2 activation, thus providing new potential therapeutical targets for stress-related disorders. Fil: Bonfiglio, Juan José. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 2013 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5306_Bonfiglio

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