Rol de la fosforilación en la regulación funcional de la proteína de movimiento TGBp1 del potato virus X

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El Potato virus X (PVX) es un virus de plantas perteneciente al género Potexvirus. Sugenoma está compuesto por una única molécula de ARN que codifica una replicasaviral, tres proteínas de movimiento (MPs: TGBp1, TGBp2 y TGBp3) y la proteína de lacápside (CP). La proteína TGBp1 es una proteína multif...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Binaghi, María
Formato: Tesis Doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2012
Materias:
TGBP1
POTATO VIRUS X
FOSFORILACION
MOVIMIENTO VIRAL
SILENCIAMIENTO MEDIADO POR ARN
REM
PHOSPHORYLATION
VIRAL MOVEMENT
RNA SILENCING
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5170_Binaghi
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description El Potato virus X (PVX) es un virus de plantas perteneciente al género Potexvirus. Sugenoma está compuesto por una única molécula de ARN que codifica una replicasaviral, tres proteínas de movimiento (MPs: TGBp1, TGBp2 y TGBp3) y la proteína de lacápside (CP). La proteína TGBp1 es una proteína multifuncional requerida para elmovimiento viral célula a célula en la planta hospedera. Se ha demostrado que esta MP es fosforilada en los residuos T193 y T214 por una quinasa tipo CK2. Diferenteslíneas de investigación sugieren que la fosforilación de las proteínas virales puederegular la replicación y el movimiento viral. El objetivo de este trabajo fue estudiar elrol de la fosforilación en la regulación funcional de la proteína de movimiento TGBp1de PVX y en su interacción con la proteína de plantas remorina (REM). Para ello seconstruyeron por mutagénesis dirigida versiones de TGBp1 no fosforilables (T193A y T214A) y otras que simulan la fosforilación (T193D y T214D). En ensayos detranscomplementación de la movilización célula a célula de un virus defectivo paradicha función, se demostró que las modificaciones en ambas treoninas resultanperjudiciales en la complementación del movimiento viral. Se determinó que lafosforilación de TGBp1 en la T193 regula la estabilidad de esta proteína viral por mediode un mecanismo que involucra la presencia de una secuencia de degradación tipo PEST en el extremo C-terminal de dicha proteína. A través de la combinación deestudios que involucran el análisis comparativo in silico de varias TGBp1s de virus delos géneros Alpha y Betaflexiviridae y de estudios por mutagénesis dirigida, sedeterminó que la T193 y la secuencia PEST C-terminal se encuentran conservadas entodas las TGBp1s analizadas, sugiriendo que la fosforilación en la T193 de estas MPssería un mecanismo regulatorio de la estabilidad de dichas proteínas. Por otra parte, elanálisis funcional de las fosfomutantes T193 y T214 de TGBp1 determinó que lafosforilación en dichos residuos afecta negativamente la actividad supresora del PTGSde TGBp1. Los ensayos de interacción entre TGBp1 de PVX y la proteína REMdeterminaron que tanto el dominio N- como el C-terminal de TGBp1 son necesariospara la interacción y que la misma no es regulada por fosforilación en los residuos T193 y T214 de TGBp1. Por otro lado, este trabajo presenta las primeras evidenciasque la interacción entre distintas proteínas TGBp1s y REM se encontraría conservadaentre los virus que utilizan estrategias de movilización del tipo Triple Bloque de Genes (TGB). Los análisis realizados para determinar el efecto biológico de REM sobre la TGBp1 de PVX demostraron que la proteína REM no interfiere en la actividad del PTGSde esta proteína viral. Finalmente estudios de localización subcelular determinaronque la localización subcelular de TGBp1 es influenciada por la presencia de las otrasproteínas virales y que a su vez varía según si la proteína se encuentra fusionada en suextremo N- o C- terminal a GFP.
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Diferenteslíneas de investigación sugieren que la fosforilación de las proteínas virales puederegular la replicación y el movimiento viral. El objetivo de este trabajo fue estudiar elrol de la fosforilación en la regulación funcional de la proteína de movimiento TGBp1de PVX y en su interacción con la proteína de plantas remorina (REM). Para ello seconstruyeron por mutagénesis dirigida versiones de TGBp1 no fosforilables (T193A y T214A) y otras que simulan la fosforilación (T193D y T214D). En ensayos detranscomplementación de la movilización célula a célula de un virus defectivo paradicha función, se demostró que las modificaciones en ambas treoninas resultanperjudiciales en la complementación del movimiento viral. Se determinó que lafosforilación de TGBp1 en la T193 regula la estabilidad de esta proteína viral por mediode un mecanismo que involucra la presencia de una secuencia de degradación tipo PEST en el extremo C-terminal de dicha proteína. A través de la combinación deestudios que involucran el análisis comparativo in silico de varias TGBp1s de virus delos géneros Alpha y Betaflexiviridae y de estudios por mutagénesis dirigida, sedeterminó que la T193 y la secuencia PEST C-terminal se encuentran conservadas entodas las TGBp1s analizadas, sugiriendo que la fosforilación en la T193 de estas MPssería un mecanismo regulatorio de la estabilidad de dichas proteínas. Por otra parte, elanálisis funcional de las fosfomutantes T193 y T214 de TGBp1 determinó que lafosforilación en dichos residuos afecta negativamente la actividad supresora del PTGSde TGBp1. Los ensayos de interacción entre TGBp1 de PVX y la proteína REMdeterminaron que tanto el dominio N- como el C-terminal de TGBp1 son necesariospara la interacción y que la misma no es regulada por fosforilación en los residuos T193 y T214 de TGBp1. Por otro lado, este trabajo presenta las primeras evidenciasque la interacción entre distintas proteínas TGBp1s y REM se encontraría conservadaentre los virus que utilizan estrategias de movilización del tipo Triple Bloque de Genes (TGB). Los análisis realizados para determinar el efecto biológico de REM sobre la TGBp1 de PVX demostraron que la proteína REM no interfiere en la actividad del PTGSde esta proteína viral. Finalmente estudios de localización subcelular determinaronque la localización subcelular de TGBp1 es influenciada por la presencia de las otrasproteínas virales y que a su vez varía según si la proteína se encuentra fusionada en suextremo N- o C- terminal a GFP. Potato virus X (PVX) is the type member of the Potexvirus genus. Its genome is basedon a single RNA molecule encoding one viral replicase protein, three movementproteins (MPs: TGBp1, TGBp2 and TGBp3) and the capsid protein (CP). In particular, TGBp1 is a multifunctional protein required for virus cell-to-cell movement inside thehost plant. Previously it has been demonstrated that TGBp1 is phosphorylated by a CK2-like kinase in T193A and T214 residues. Recent works on other plant viruses haveindicated that viral protein phosphorylation by host kinases can regulate processessuch us viral replication and mobilization. The aim of this work is to evaluate the roleof phosphorylation in regulating the functional activities of the movement protein TGBp1 of PVX and its interaction with the protein Remorin (REM). For this aimdifferent TGBp1 mutants have been developed by direct mutagenesis where theidentified threonines have been replaced by alanine (T193A and T214A) or aspartate (T193D and T214D) residues. The virus movement function of the phosphomutantswas assessed by complementation of PVX cell-to-cell movement in trans. It was shownthat all mutants were non-functional for virus movement, and that phosphorylation of T193 is essential for stability of the MP by a degradation mechanism that involves a PEST sequence at the C-terminus of TGBp1. Several experimental approaches involvingsequence comparison among TGBp1 homologues from viruses belonging to the Alphaand Betaflexiviridae genera and direct mutagenesis show that the T193 residue andthe PEST sequence are conserved among all TGBp1 analyzed, suggesting thatphosphorylation of T193 in these MPs could be a mechanism by which protein stabilityis regulated in several viruses. The results obtained in this work also have shown thatphosphorylation of T193 and T214 of TGBp1 negatively affects the PTGS suppressionactivity of this MP. Two-hybrid assays and pull down experiments demonstrated thatthe N- and C-term domain of TGBp1 are involved in the interaction between PVX TGBp1 and REM and that this interaction is not regulated by TGBp1 phosphorylation. In addition, this work presents the first evidence that the interaction between REMand other TGBp1s could be a conserved mechanism used by different TGB-containingviruses. The studies conducted to determine the biological effect of REM on TGBp1from PVX showed that REM protein does not interfere with PTGS- suppressing activityof TGBp1. Finally, sub-cellular localization studies demonstrated that TGBp1localization is influenced by the presence of other viral proteins and by the use of N- or C-terminal GFP fusion proteins. Fil: Binaghi, María. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 2012 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5170_Binaghi

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