Detección de endotoxinas : bases para un ensayo de reconocimiento molecular

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Las endotoxinas, también conocidas como pirógenos, son constituyentes de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas. Ellas son responsables de inducir fiebre y la disfunción progresiva de distintos órganos cuando ingresan al torrente sanguíneo. Los métodos aceptados para su detección son mé...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Priano, Graciela Inés
Formato: Tesis Doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2006
Materias:
LPS
LIPOPOLISACARIDOS
PIROGENOS
ENDOTOXINAS
ENSAYO COMPETITIVO
ENSAYO AMPEROMETRICO
LIPOPOLYSACCHARIDES
PYROGENS
ENDOTOXINS
AMPEROMETRIC ASSAY
COMPETITIVE ASSAY
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3943_Priano
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description Las endotoxinas, también conocidas como pirógenos, son constituyentes de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas. Ellas son responsables de inducir fiebre y la disfunción progresiva de distintos órganos cuando ingresan al torrente sanguíneo. Los métodos aceptados para su detección son métodos biológicos: el ensayo LAL, basado en la gelificación del lisado de amebocitos provenientes del cangrejo herradura y el ensayo en conejos. En el presente trabajo, se estudió la interacción de las endotoxinas con una proteína de reconocimiento inmovilizada sobre dos superficies distintas con el propósito de desarrollar un ensayo competitivo amperométrico. El primer escalón en este trabajo fue realizar una detallada investigación acerca de este tipo de moléculas. Ellas son lipopolisacáridos que presentan ciertas características peculiares: la formación de agregados aún a muy bajas concentraciones, la alta variabilidad en su peso molecular y la dificultad para determinar su presencia por métodos analíticos convencionales. Fueron establecidos un método para su purificación y pautas para la manipulación y operatoria con este reactivo. Fueron estudiadas dos configuraciones de electrodos modificados utilizando como elemento de reconocimiento una proteína recombinante, Endotoxin Neutralizing Protein (ENP), que reconoce específicamente una porción altamente conservada de este conjunto de moléculas. La construcción de los electrodos fue seguida por técnicas electroquímicas y elipsometría, mientras que su funcionamiento fue evaluado en un ensayo competitivo, utilizando como elemento generador de la señal, un lipopolisacárido modificado con HRP. Los electrodos construidos por interacción electrostática entre ENP y un polímero electroactivo permitieron detectar la presencia de endotoxinas en concentraciones tan bajas como 0.2 EU mL^-1. Los electrodos construidos por unión covalente de ENP a una matriz de carboximetil dextran mostraron un mayor rango dinámico pero también un mayor límite de detección. Se presentó un modelo cinético para evaluar la respuesta electroquímica teniendo en cuenta los distintos métodos de inmovilización.
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