Estudio del rol de la tetraspanina CD63 en células dendríticas humanas y su participación en la internalización de antígenos

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Trabajos previos de nuestro laboratorio han permitido desarrollar un anticuerpo monoclonal (AMC) murino denominado FC-5.01, usando como inmunógeno la línea celular de carcinoma mamario humano indiferenciado IIB-BR-G. Se identificó el antígeno reconocido por FC-5.01 como la Tetraspanina CD63/lamp 3....

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Mantegazza, Adriana R.
Formato: Tesis Doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2005
Materias:
CELULAS DENDRITICAS
TETRASPANINA CD63
ANTICUERPO MONOCLONAL FC-05.01
TRAFICO INTRACELULAR
FAGOCITOSIS
QUIMIOTAXIS
MOLECULA RECOMBINANTE SINGLE
CHAIN FV
DENDRITIC CELLS
TETRASPANIN CD63
MONOCLONAL ANTIBODY FC-5.01
INTRACELLULAR TRAFFIC
PHAGOCYTOSIS
CHEMOTAXIS
RECOMBINANT MOLECULE SCFV
Acceso en línea:http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3817_Mantegazza
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description Trabajos previos de nuestro laboratorio han permitido desarrollar un anticuerpo monoclonal (AMC) murino denominado FC-5.01, usando como inmunógeno la línea celular de carcinoma mamario humano indiferenciado IIB-BR-G. Se identificó el antígeno reconocido por FC-5.01 como la Tetraspanina CD63/lamp 3. La tetraspanina CD63 está presente en la superficie y en endosomas y lisosomas de células de melanoma, células dendríticas (CDs) y macrófagos; también se encuentra en vesículas secretorias, como los cuerpos de Weibel-Palade de células endoteliales, gránulos citolíticos de células T citotóxicas, gránulos α de plaquetas y gránulos de basófilos, neutrófilos y eosinófilos, localizándose en la membrana plasmática luego de la activación de dichas células. Observamos que el AMC FC-5.01 reconoce CDs humanas obtenidas a partir del cultivo de monocitos de sangre periférica en presencia de interleuquina-4 (IL-4) y factor estimulador de coloninas granulocito-monocito (GM-CSF). Demostramos mediante inmunofluorescencia y microscopía confocal que el complejo de superficie FC-5.01-CD63 se internaliza en CDs, siguiendo el trayecto endosomal-lisosomal, y alcanza los compartimentos enriquecidos en moléculas MHC de clase II (MIICs), donde tiene lugar el procesamiento y cargado de los péptidos a ser presentados en el contexto de las moléculas clase II. Detectamos que las tetraspaninas CD9, CD81, CD82 y CD151 también se expresan en CDs. CD9 y CD81 se localizan predominantemente en la superficie celular, mientras que CD63 y CD82 también se expresan intracelularmente. La incubación con AMCs anti-CD9, CD63, CD81 y CD82 causa un aumento de la migración celular inducida por los quimioatractantes MIP-1α y MIP-5, entre un 50% y un 70%. La incubación con todos los AMCs simultáneamente produce un aumento de casi un 100% en la quimiotaxis celular. Mediante inmunofluorescencia e inmunoprecipitación, demostramos la asociación entre tetraspaninas y ciertas integrinas. Proponemos que CD63 está involucrado en la captura selectiva de antígenos (Ags) por las CDs. Observamos que la fagocitosis de S. cerevisiae, pero no la endocitosis de FITC-dextrán ni la captura de partículas de látex, produce una disminución en la expresión de superficie de CD63. Visualizamos mediante microscopía que CD63 acompaña la fagocitosis de S. cerevisiae y se localiza en organelas intracelulares conteniendo las levaduras fagocitadas. Mediante inmunoprecipitación detectamos la asociación entre CD63 y el receptor de β-glucanos dectin-1, el cual participa en la captura de levaduras por las CDs. CD63 no parece estar asociado con el receptor de manosa (MR) ni el DC-SIGN, reponsable de la entrada de varios patógenos a las CDs, como el virus del dengue. A partir del hibridoma productor del AMC FC-5.01 construimos una molécula recombinante “single-chain Fv” (scFv), mediante el ensamblado de las porciones variables de la cadena pesada (VH) y la cadena liviana (VL) del AMC por medio de un péptido espaciador. La molécula recombinante scFv-5.01 mantiene la especificidad en el reconocimiento de CD63. El complejo de superficie scFv-5.01-CD63 se internaliza y alcanza los compartimentos MIIC en CDs, al igual que el anticuerpo parental. Partiendo de dicha construcción, generamos una proteína de fusión portando el péptido de melanoma MART-1 (scFv-5.01-MART-1), la cual también mantiene la reactividad del anticuerpo parental contra CD63 y alcanza los compartimentos MIIC al internalizarse en CDs. Por último, conjugamos químicamente el AMC FC-5.01 con una proteína altamente inmunogénica como el toxoide tetánico (TT). Comprobamos que el conjugado FC-5.01-TT retiene la especificidad del anticuerpo parental por CD63, se internaliza en CDs, alcanza los compartimentos MIIC, es presentado por dichas células y genera una respuesta específica de linfocitos autólogos de dadores vacunados contra el tétanos. Por lo todo lo expuesto, consideramos que el AMC FC-5.01 o sus fragmentos derivados podrían ser utilizados como vehículo de péptidos o proteínas antigénicas de interés hacia las CDs, las cuales presentarían dichos Ags y generarían una respuesta inmune específica. Nuestros resultados aportaron también nueva evidencia acerca del posible rol de CD63 y otras tetraspaninas en CDs.
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La tetraspanina CD63 está presente en la superficie y en endosomas y lisosomas de células de melanoma, células dendríticas (CDs) y macrófagos; también se encuentra en vesículas secretorias, como los cuerpos de Weibel-Palade de células endoteliales, gránulos citolíticos de células T citotóxicas, gránulos α de plaquetas y gránulos de basófilos, neutrófilos y eosinófilos, localizándose en la membrana plasmática luego de la activación de dichas células. Observamos que el AMC FC-5.01 reconoce CDs humanas obtenidas a partir del cultivo de monocitos de sangre periférica en presencia de interleuquina-4 (IL-4) y factor estimulador de coloninas granulocito-monocito (GM-CSF). Demostramos mediante inmunofluorescencia y microscopía confocal que el complejo de superficie FC-5.01-CD63 se internaliza en CDs, siguiendo el trayecto endosomal-lisosomal, y alcanza los compartimentos enriquecidos en moléculas MHC de clase II (MIICs), donde tiene lugar el procesamiento y cargado de los péptidos a ser presentados en el contexto de las moléculas clase II. Detectamos que las tetraspaninas CD9, CD81, CD82 y CD151 también se expresan en CDs. CD9 y CD81 se localizan predominantemente en la superficie celular, mientras que CD63 y CD82 también se expresan intracelularmente. La incubación con AMCs anti-CD9, CD63, CD81 y CD82 causa un aumento de la migración celular inducida por los quimioatractantes MIP-1α y MIP-5, entre un 50% y un 70%. La incubación con todos los AMCs simultáneamente produce un aumento de casi un 100% en la quimiotaxis celular. Mediante inmunofluorescencia e inmunoprecipitación, demostramos la asociación entre tetraspaninas y ciertas integrinas. Proponemos que CD63 está involucrado en la captura selectiva de antígenos (Ags) por las CDs. Observamos que la fagocitosis de S. cerevisiae, pero no la endocitosis de FITC-dextrán ni la captura de partículas de látex, produce una disminución en la expresión de superficie de CD63. Visualizamos mediante microscopía que CD63 acompaña la fagocitosis de S. cerevisiae y se localiza en organelas intracelulares conteniendo las levaduras fagocitadas. Mediante inmunoprecipitación detectamos la asociación entre CD63 y el receptor de β-glucanos dectin-1, el cual participa en la captura de levaduras por las CDs. CD63 no parece estar asociado con el receptor de manosa (MR) ni el DC-SIGN, reponsable de la entrada de varios patógenos a las CDs, como el virus del dengue. A partir del hibridoma productor del AMC FC-5.01 construimos una molécula recombinante “single-chain Fv” (scFv), mediante el ensamblado de las porciones variables de la cadena pesada (VH) y la cadena liviana (VL) del AMC por medio de un péptido espaciador. La molécula recombinante scFv-5.01 mantiene la especificidad en el reconocimiento de CD63. El complejo de superficie scFv-5.01-CD63 se internaliza y alcanza los compartimentos MIIC en CDs, al igual que el anticuerpo parental. Partiendo de dicha construcción, generamos una proteína de fusión portando el péptido de melanoma MART-1 (scFv-5.01-MART-1), la cual también mantiene la reactividad del anticuerpo parental contra CD63 y alcanza los compartimentos MIIC al internalizarse en CDs. Por último, conjugamos químicamente el AMC FC-5.01 con una proteína altamente inmunogénica como el toxoide tetánico (TT). Comprobamos que el conjugado FC-5.01-TT retiene la especificidad del anticuerpo parental por CD63, se internaliza en CDs, alcanza los compartimentos MIIC, es presentado por dichas células y genera una respuesta específica de linfocitos autólogos de dadores vacunados contra el tétanos. Por lo todo lo expuesto, consideramos que el AMC FC-5.01 o sus fragmentos derivados podrían ser utilizados como vehículo de péptidos o proteínas antigénicas de interés hacia las CDs, las cuales presentarían dichos Ags y generarían una respuesta inmune específica. Nuestros resultados aportaron también nueva evidencia acerca del posible rol de CD63 y otras tetraspaninas en CDs. Our laboratory has previously produced a monoclonal antibody (Mab) named FC-5.01, immunizing mice with a human breast cancer cell line (IIB-BR-G) derived from a highly undifferentiated breast tumor. FC-5.01 recognizes Tetraspanin CD63. Tetraspanin CD63 is expressed on the surface and in endosomes and lysosomes of melanoma cells, dendritic cells (DCs) and macrophages; it is also found in secretory vesicles, such as Weibel-Palade bodies from endothelial cells, cytolytic granules from cytotoxic T cells, α granules from platelets and granules from basophils, neutrophils and eosinophils, translocating to the plasma membrane after cellular activation. We have observed that Mab FC-5.01 recognizes human DCs obtained from the culture of peripheral blood monocytes in the presence of interleukine-4 (IL-4) and granulocyte-monocyte colony stimulating factor (GM-CSF). We have demonstrated, by immunofluorescence and confocal microscopy, that the surface complex FC-5.01-CD63 internalizes in CDs, follows the endosomal-lysosomal route and reaches the compartments enriched in MHC class II molecules (MIICs), where antigen processing and peptide loading takes place for class II presentation to occur. We have detected that tetraspanins CD9, CD81, CD82 and CD151 are also expressed in DCs. CD9 and CD81 are localized preferentially at the DCs cell surface, while CD63 and CD82 are also expressed intracellularly. The incubation with Mabs directed to CD9, CD63, CD81 and CD82 increase cellular migration driven by chemoattractants MIP-1α y MIP-5 between 50% and 70%.When Mabs against all the tetraspanins studied are added together, migration increases almost 100%. By immunofluorescence and immunoprecipitation we have demonstrated the association between tetraspanins and certain integrins. We propose that CD63 is involved in the selective capture of antigens (Ags) by DCs. We have observed that S. cerevisiae phagocytosis, but neither FITC-dextran endocytosis nor latex beads capture, causes the decrease on CD63 surface expression. We have visualized by microscopy that CD63 accompanies S. cerevisiae phagocytosis and localizes in intracellular organelles containing phagocytosed yeasts. We have detected, by immunoprecipitation, the association between CD63 and the β-glycan receptor dectin-1, which is involved in the capture of yeasts by DCs. CD63 does not seem to be associated neither with mannose receptor (MR) nor with DC-SIGN, which takes part in the entry of several pathogens in DCs, such as dengue virus. We have constructed a recombinant molecule “single-chain Fv” (scFv), making use of FC-5.01 hybridoma, joining the variable portions of FC-5.01 heavy (VH) and light (VL) chains by a flexible peptide linker. The recombinant molecule scFv-5.01 recognizes CD63 on the surface of DCs. The complex scFv-5.01-CD63 internalizes and reaches MIIC compartments, like the parental antibody. We have further generated a fusion protein carrying the melanoma peptide MART-1 (scFv-5.01-MART-1), which also keeps the reactivity of the whole antibody towards CD63 and reaches MIICs after internalization. Finally, we have chemically conjugated Mab FC-5.01 with a highly immunogenic protein, such as tetanus toxoid (TT). We have verified that FC-5.01-TT recognizes CD63, internalizes, reaches MIICs and is presented by DCs, generating a specific response from autologous lymphocytes responsive to TT. Therefore, we think that Mab FC-5.01 or its derived fragments could be used as vehicle for antigenic peptides or proteins of interest in DCs, which would present these antigens and could generate a specific immune response. Our results have also provided new evidence about the possible role of CD63 and other tetraspanins in DCs. Fil: Mantegazza, Adriana R.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 2005 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3817_Mantegazza

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