Mecanismos involucrados en la adquisición de la hormono-independncia : interacción entre receptores de progesterona y otras vías de señalización

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En este trabajo de Tesis se evaluaron las siguientes hipótesis: 1. El receptor de progesterona (RP) está involucradoen el crecimiento tumoral progestágeno-independiente (PI). 2. Vias preliferativas activadas por factores de crecimiento activan al RP. 3. Factores del estrema tumoral participan en la...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Lamb, Caroline A.
Formato: Tesis Doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2003
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3612_Lamb
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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En pasajes sucesivospueden adquirir un fenotipo progestágeno-independiente, independizándose del requerimiento dehormonas, pero aún así mantienen la expresión de RE y RP. Un estudio de comportamiento de unaserie de tumores PI, nos condujo a subclasificarlos en respondedores (PI-R) o no respondedores (PI-NR) (Helguero y col. Breast Cancer Res and Treat 79: 379-390, 2003) de acuerdo a la sensibilidad invivo para regresionar con el tratamiento a antiprogestágenos. Para evaluar si existen factores de crecimiento capaces de reemplazar a los progestágenos enla estimulación de la proliferación celular en cultivos primarios de un tumor PD, el CC4-HD, usamos albFGF y bloqueamos el RP mediante el uso de antiprogestágenos (RU 486 y ZK 299) y mediante el usode oligonucleótidos antisentido. En todos los casos el bloqueo del RP inhibió la proliferación celularinducida por MPA, factores séricos o bFGF, de manera específica. Resultados similares se obtuvieronutilizando cultivos primarios de 3 tumores PI diferentes: 59-2-HI, C7-2-HI y CC4-HI. Estudios de Mobility Gel Shift confirmaron que tanto el MPA como el bFGF pueden inducir laactivación del RP en células en cultivo y que los mismos se encuentran constitutivamente activados encultivos primarios de tumores PI. Por otra parte se demostró que in vivo la terapia con oligonucleótidos antisentido de RP fuecapaz de inducir una inhibición del crecimiento tumoral. Los tumores de animales tratados mostraronuna significativa reducción de células en fase proliferativa y en la expresión de RP. Se observóincremento de apoptosis sólo en un tumor en el cual el tratamiento indujo reducción de tamaño. Para evaluar la expresión del bFGF y los receptores (RFGF 1 al 4) en los tumores PD y PIprocedimos a evaluar primero su expresión en distintos estadios del desarrollo de glándulas mamariasnormales por inmunohistoquímica. Si bien la expresión de bFGF en la mama normal de ratón ya estabareportada, nuestros estudios revelaron una regulación de la expresión en el desarrollo. Los 4receptores también se expresan en las mamas normales y su expresión también está regulada en losdistintos estadíos del desarrollo. Por inmunohistoquímica o inmunofluorescencia no se detectaron diferencias evaluables deexpresión de bFGF o de sus receptores entre tumores PD y PI-R; si bien se pudo determinar lamarcación de bFGF predominantemente estromal y la de los receptores en el parénquima tumoral. Los RFGF 2 y 3 están ampliamente expresados con localización nuclear además de la convencional. Debido a que con la técnica inmunohistoquímica no se puede discriminar entre las distintasisoformas de bFGF, se hicieron estudios de Western blots para identificar la isofonna clásica de 16kDa. Se detectó una mayor expresión de esta isoforma cuando los tumores PD crecían en ausencia deprogestágenos. Para poder evaluar mejor la contribución de las células epiteliales o los fibroblastos enla expresión de bFGF, separamos ambas poblaciones y se hicieron cultivos primarios. Observamosmayor expresión de bFGF en los fibroblastos estromales de tumores PI que en los de tumores PD. Ensu conjunto estos datos indicarían que el bFGF estromal podría contribuir a inducir la proliferacióncelular en tumores PI a través de la activación de RP. En co-cultivos de células epiteliales obtenidas deun tumor PD con fibroblastos estromales obtenidos de un tumor PD o de uno PI se demostró queambos fibroblastos ejercían un efecto sinérgico de la proliferación celular y que este efecto era mayorcon los fibroblastos PI. A la inversa, células epiteliales PI cultivadas con fibroblastos PD crecieron máslentamente que al cultivarlas con fibroblastos PI. En el primer capitlo concluímos que los tumores con fenotipo PD y los PI-R necesitan de un RP funcional para proliferar y que el estroma cumple una participación activa en el crecimiento tumoral. En el crecimiento PI-R, el bFGF junto con otros factores provenientes del estroma podría estaractivando los RP presentes en el parénquima, contribuyendo al fenotipo PI. El estroma PI liberaría unamayor cantidad de factores en respuesta a señales del parénquima. En el segundo capítulo estudiamos la participación del RE en el crecimiento tumoral PD y paraello bloqueamos el REα con un antiestrógeno puro, el ICI 182.780 y oligonucleótidos antisentido de REα. Como resultado, en ambos casos obtuvimos una inhibición de la proliferación celularacompañada por una disminución de expresión de RP, sugiriendo que el REα participa en elcrecimiento PD y que la alta expresión de RP pueda deberse a la presencia de RE activados. En el tercer y último capítulo estudiamos el efecto de dos SERMs, y del antiestrógeno puro ICI 182.780, utilizados en la clínica sobre el crecimiento de un tumor PD y sobre la síntesis de RP. El ICI 182.780, el tamoxifeno y el raloxifeno mostraron efectos inhibitorios per se en el crecimiento in vitro aligual que el 17-β—estradiol (E2) pero en mayores concentraciones. El raloxifeno indujo una estimulaciónde la proliferación en presencia de progestágenos. EI ICI 182.780 y el raloxifeno revirtieron el efectoinhibitorio del E2 mientras que el tamoxifeno fue inhibitorio. El ICI 182.780 disminuyó la síntesis de RPmientras que el tamoxifeno y el E2 los aumentaron y el raloxifeno no tuvo efectos significativos. Concluimos que el tamoxifeno tiene un efecto similar al observado en la clínica en nuestro modeloexperimental inhibiendo el crecimiento tumoral y aumentando la expresión de RP. Estos resultados nosllevan a hipotetizar que el tamoxifeno pueda ejercer efectos inhibitorios por su efecto estrogénico levemás que por su acción antiestrogénica. En conjunto estos resultados: a) jerarquizan el rol del receptor de progesterona en elcrecimiento de carcinomas mamarios, b) brindan al estroma un posible rol protagónico en la adquisiciónde la hormono-independencia y c) la similitud entre los efectos del tamoxifeno obtenidos en la clínica yen estos tumores son interesantes para validar aún más los dos ítems anteriores en cuanto a surelevancia clínica.
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spelling todo:tesis_n3612_Lamb2023-10-03T12:41:52Z Mecanismos involucrados en la adquisición de la hormono-independncia : interacción entre receptores de progesterona y otras vías de señalización Lamb, Caroline A. En este trabajo de Tesis se evaluaron las siguientes hipótesis: 1. El receptor de progesterona (RP) está involucradoen el crecimiento tumoral progestágeno-independiente (PI). 2. Vias preliferativas activadas por factores de crecimiento activan al RP. 3. Factores del estrema tumoral participan en la transición hacia la hormono-independenciaactivando RP. 4. Los receptores de estrógenos alfa (REα) tienen un rol en el crecimiento tumoralpregestágeno-dependiente (PD). Los ensayos se realizaron en un modelo experimental de inducción de cáncer de mama poradministración prolongada de acetato de medroxiprogesterona (MPA) en ratones hembras vírgenes dela cepa BALB/c. Los tumores utilizados fueron todos carcinomas ductales metastáticos con altocontenido de RE y RP, que se comportan como hormono-dependientes en los primeros pasajessubcutáneos singeneicos, creciendo sólo en presencia de progestágenos. En pasajes sucesivospueden adquirir un fenotipo progestágeno-independiente, independizándose del requerimiento dehormonas, pero aún así mantienen la expresión de RE y RP. Un estudio de comportamiento de unaserie de tumores PI, nos condujo a subclasificarlos en respondedores (PI-R) o no respondedores (PI-NR) (Helguero y col. Breast Cancer Res and Treat 79: 379-390, 2003) de acuerdo a la sensibilidad invivo para regresionar con el tratamiento a antiprogestágenos. Para evaluar si existen factores de crecimiento capaces de reemplazar a los progestágenos enla estimulación de la proliferación celular en cultivos primarios de un tumor PD, el CC4-HD, usamos albFGF y bloqueamos el RP mediante el uso de antiprogestágenos (RU 486 y ZK 299) y mediante el usode oligonucleótidos antisentido. En todos los casos el bloqueo del RP inhibió la proliferación celularinducida por MPA, factores séricos o bFGF, de manera específica. Resultados similares se obtuvieronutilizando cultivos primarios de 3 tumores PI diferentes: 59-2-HI, C7-2-HI y CC4-HI. Estudios de Mobility Gel Shift confirmaron que tanto el MPA como el bFGF pueden inducir laactivación del RP en células en cultivo y que los mismos se encuentran constitutivamente activados encultivos primarios de tumores PI. Por otra parte se demostró que in vivo la terapia con oligonucleótidos antisentido de RP fuecapaz de inducir una inhibición del crecimiento tumoral. Los tumores de animales tratados mostraronuna significativa reducción de células en fase proliferativa y en la expresión de RP. Se observóincremento de apoptosis sólo en un tumor en el cual el tratamiento indujo reducción de tamaño. Para evaluar la expresión del bFGF y los receptores (RFGF 1 al 4) en los tumores PD y PIprocedimos a evaluar primero su expresión en distintos estadios del desarrollo de glándulas mamariasnormales por inmunohistoquímica. Si bien la expresión de bFGF en la mama normal de ratón ya estabareportada, nuestros estudios revelaron una regulación de la expresión en el desarrollo. Los 4receptores también se expresan en las mamas normales y su expresión también está regulada en losdistintos estadíos del desarrollo. Por inmunohistoquímica o inmunofluorescencia no se detectaron diferencias evaluables deexpresión de bFGF o de sus receptores entre tumores PD y PI-R; si bien se pudo determinar lamarcación de bFGF predominantemente estromal y la de los receptores en el parénquima tumoral. Los RFGF 2 y 3 están ampliamente expresados con localización nuclear además de la convencional. Debido a que con la técnica inmunohistoquímica no se puede discriminar entre las distintasisoformas de bFGF, se hicieron estudios de Western blots para identificar la isofonna clásica de 16kDa. Se detectó una mayor expresión de esta isoforma cuando los tumores PD crecían en ausencia deprogestágenos. Para poder evaluar mejor la contribución de las células epiteliales o los fibroblastos enla expresión de bFGF, separamos ambas poblaciones y se hicieron cultivos primarios. Observamosmayor expresión de bFGF en los fibroblastos estromales de tumores PI que en los de tumores PD. Ensu conjunto estos datos indicarían que el bFGF estromal podría contribuir a inducir la proliferacióncelular en tumores PI a través de la activación de RP. En co-cultivos de células epiteliales obtenidas deun tumor PD con fibroblastos estromales obtenidos de un tumor PD o de uno PI se demostró queambos fibroblastos ejercían un efecto sinérgico de la proliferación celular y que este efecto era mayorcon los fibroblastos PI. A la inversa, células epiteliales PI cultivadas con fibroblastos PD crecieron máslentamente que al cultivarlas con fibroblastos PI. En el primer capitlo concluímos que los tumores con fenotipo PD y los PI-R necesitan de un RP funcional para proliferar y que el estroma cumple una participación activa en el crecimiento tumoral. En el crecimiento PI-R, el bFGF junto con otros factores provenientes del estroma podría estaractivando los RP presentes en el parénquima, contribuyendo al fenotipo PI. El estroma PI liberaría unamayor cantidad de factores en respuesta a señales del parénquima. En el segundo capítulo estudiamos la participación del RE en el crecimiento tumoral PD y paraello bloqueamos el REα con un antiestrógeno puro, el ICI 182.780 y oligonucleótidos antisentido de REα. Como resultado, en ambos casos obtuvimos una inhibición de la proliferación celularacompañada por una disminución de expresión de RP, sugiriendo que el REα participa en elcrecimiento PD y que la alta expresión de RP pueda deberse a la presencia de RE activados. En el tercer y último capítulo estudiamos el efecto de dos SERMs, y del antiestrógeno puro ICI 182.780, utilizados en la clínica sobre el crecimiento de un tumor PD y sobre la síntesis de RP. El ICI 182.780, el tamoxifeno y el raloxifeno mostraron efectos inhibitorios per se en el crecimiento in vitro aligual que el 17-β—estradiol (E2) pero en mayores concentraciones. El raloxifeno indujo una estimulaciónde la proliferación en presencia de progestágenos. EI ICI 182.780 y el raloxifeno revirtieron el efectoinhibitorio del E2 mientras que el tamoxifeno fue inhibitorio. El ICI 182.780 disminuyó la síntesis de RPmientras que el tamoxifeno y el E2 los aumentaron y el raloxifeno no tuvo efectos significativos. Concluimos que el tamoxifeno tiene un efecto similar al observado en la clínica en nuestro modeloexperimental inhibiendo el crecimiento tumoral y aumentando la expresión de RP. Estos resultados nosllevan a hipotetizar que el tamoxifeno pueda ejercer efectos inhibitorios por su efecto estrogénico levemás que por su acción antiestrogénica. En conjunto estos resultados: a) jerarquizan el rol del receptor de progesterona en elcrecimiento de carcinomas mamarios, b) brindan al estroma un posible rol protagónico en la adquisiciónde la hormono-independencia y c) la similitud entre los efectos del tamoxifeno obtenidos en la clínica yen estos tumores son interesantes para validar aún más los dos ítems anteriores en cuanto a surelevancia clínica. In this Thesis work we have tested the following hypothesis: 1. Progesterone receptors (PR) are involved in progestin-independent (PI) tumor growth. 2. Proliferative pathways activated by growth factors activate PR. 3. Tumor stromal factors activate PR and participate in the transition to hormone-independency. 4. Estrogen receptors alpha (ERα) are involved in progestin-dependent (PD) tumor growth. All experiments were carried out in an experimental model in which the continuousadministration of medroxyprogesterone acetate (MPA) to virgin BALB/c female mice induces mammarycarcinomas. The tumors are metastatic ductal carcinomas expressing high levels of PR and ER showinga hormone-dependent growth pattern in syngeneic passages, since they only grow in the presence of MPA. In successive passages the tumors may acquire a progestin-independent phenotype and they cangrow in the absence of MPA, even though they retain ER and PR levels. In a recent work of ourlaboratory (Helguera et al Breast Cancer Research and Treatment 79: 379-390, 2003) we classified PItumors in responsive (PI-R) and unresponsive (PI-UR) based on their capacity to regress withantiprogestin treatment. In order to evaluate the ability of growth factors to mimic the stimulatory effect of progestins oncell proliferation, primary cultures of the PD tumor line (CC4-HD), were used. Cells were incubated witheither MPA or bFGF and PR expression was blocked using antiprogestins or antisense oligonucleotides. Both treatments were able to reduce significantly ³H-thymidine uptake and cell number suggesting that PR are mediating bFGF induced cell proliferation. Using primary cultures from three different PI tumors: 59-2-HI, C7-2-HI and CC4-HI we were also able to demonstrate that antiprogestins and antisenseoligonucleotides were able to inhibit cell growth. Specificity of antisense treatment was assessed usingunrelated cells and using scrambled oligonucleotides. The elfectiveness was assessed by Western blotsand by binding techniques. Mobility Gel Shift studies confirmed that both MPA and bFGF can induce PRactivation in PD cells and that PR are constitutively activated in primary cultures of PI tumors. On the other hand, these in vitro studies were supported by in vivo assays in which wedemonstrated that antisense therapy using phosphorothioated oligonucleotides inhibited tumor growth. Tumors from antisense-treated animals showed a significant reduction of proliferating cells and PRexpression, while no differences were found when comparing tumors from scrambled- treated or controlmice. We next wanted to explore the expression of bFGF and its receptors (FGFR 1 to 4) in PD and PI tumors and in different developmental stages of normal mammary glands. The presence anddistribution of bFGF in normal murine mammary gland has already been described, but no studiesregarding its expression in different developmental stages have been acknowledged. The four receptorswere present in normal mammary glands and their expression, as bFGF, were also regulated in thedifferent developmental stages. Immunofluorescence and immunohistochemical studies did not reveal any significantdifferences in bFGF and FGFR expression between PD and PI tumors; although we could determine abasically stromal and parenchymal staining for bFGF and FGFR respectively. FGFR-2 and FGFR-3were expressed in the nuclei of parenchymal cells in addition to the reported conventional localization. Immunohistochemical studies could not distinguish between the different bFGF isoforms so Western blot assays were used to determine the expression of the classical bFGF isoform of 16 kDa. This isoform was highly expressed in tumors from untreated as compared to MPA-treated mice. AsbFGF was more expressed in stroma than in the parenchyma of both PD and PI tumors and to furtherevaluate the contribution of epithelial or fibroblastic cells to bFGF expression, we separated bothpopulations obtaining tumor epithelial or fibroblastic enriched primary cultures. An impressive increasein bFGF expression was observed in stromal fibroblasts from PI tumors as compared to those of PDtumors. On the other hand, epithelial PD cells co-cultivated with fibroblastic PD cells or with Plfibroblasts showed that both fibroblastic populations had a synergic effect on cell proliferation but thiseffect was greater when epithelial PD cells were co cultured together with PI fibroblasts. These dataaltogether indicate that stromal bFGF could contribute to activate cell proliferation in PI tumors through PR activation. In the first chapter we concluded that PD and PI-R tumors need a functional PR in order toproliferate and that the stroma has an active role in tumor growth. In Pl-R tumor growth, bFGF and otherfactors coming from the stroma could be activating PRs present in tumor parenchyma, contributing tothe PI phenotype. In the second chapter we studied the role of ER in PD tumor growth. We blocked ERα with apure antiestrogen (ICI 182.780) and antisense oligonucleotides to ERα. As a result, in both cases cellproliferation was inhibited and this was associated to a decrease in PR expression, suggesting that ERα participates in PD tumor growth and that the high levels of PR expression may be due toconstitutive ER activation. In the last chapter, we studied the effects of two SERMs and a pure antiestrogen (ICI 182.780)commonly used in clinical studies, on PD tumor growth and on PR synthesis. ICI 182.780, tamoxifenand raloxifene disclosed inhibitory effects per se in in vitro cell proliferation as 17-β-estradiol (E2)although at higher concentrations. Raloxifene stimulated cell proliferation in the presence of MPA. ICl 182.780 and raloxifene reversed E2 inhibitory effect whereas tamoxifen was inhibitory. ICI 182.780reduced PR expression while tamoxifen and E2 increased them and raloxifene had no significant effect. We conclude that tamoxifen has a similar effect to that observed in the clinic in our experimental modelinhibiting tumor growth and increasing PR expression. These results led us to hypothesize thattamoxifen can exert its inhibitory effects as a result of small estrogenic effects and not because of itsantiestrogenic action. Altogether our results: a) underline the role of PRs in the growth of mammary carcinomas, b)highlight the role of stromal factors in the acquisition of hormone-independence and c) the similaritybetween the effects of tamoxifen obtained in the clinic and in our tumors validate even further ourexperimental model of breast cancer highlighting the clinical relevance of the two items describedabove. Fil: Lamb, Caroline A.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 2003 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3612_Lamb

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