Aspectos básicos y aplicados de la genética molecular de Bacillus thuringiensis
Los inoculantes basados en Rhizobium son ampliamente usados en plantasluguminosas. Actualmente cepas bacterianas con funciones duales (porejemplo: fijación de nitrógeno y actividad insecticida) pueden ser unaalternativa para el manejo orgánico de pestes de insectos (Madhavi et al., 1993 and 1994). T...
Guardado en:
| Autor principal: | |
|---|---|
| Formato: | Tesis Doctoral |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
1999
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| Materias: | |
| Acceso en línea: | https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3106_GuerchicoffLemcke |
| Aporte de: |
| Sumario: | Los inoculantes basados en Rhizobium son ampliamente usados en plantasluguminosas. Actualmente cepas bacterianas con funciones duales (porejemplo: fijación de nitrógeno y actividad insecticida) pueden ser unaalternativa para el manejo orgánico de pestes de insectos (Madhavi et al., 1993 and 1994). También pueden ser usadas para proteger semillas,reduciendo el uso de insecticidas químicos. El gen cry 4B de B. thuringiensisisraelensis que codifica para una proteína tóxica para díptero fue usado comomodelo. Para introducir dicho gen se usó el plásmido pTR101, un vectoraltamente estable, en Rhizobium en ausencia de presión de selección. Lasconstrucciones fueron introducidas en Rhizobium fredii 191 y Rhizobiummeliloti 1021, mediante conjugación tripartita con un plásmido ayudante. La expresión fue estudiada mediante Western blot de extractos crudosutilizando un anticuerpo específico contra la proteína Cry4B recombinante. Seobservaron reareglos que dieron lugar a deleciones, pero a pesar de esto unpolipéptido reactivo se detectó en ambos Rhizobios. Dado que en Argentina muchas pestes de coleópteros y nematodosconstituyen un serio problema para cultivos de alfalfa y soja, entre otros, elgen cry3A de B.thuringiensis tenebrionis (Krieg et al., 1983) fue introducidoen Rhizobium meliloti 1021. Se eligió al vector de amplio rango pRK404, paraevitar que se produzcan reareglos. Este plásmido posee un origen dereplicación derivado del RK2, lleva resistencia a kanamicina, puede sermovilizado con una alta frecuencia usando un plásmido ayudante. Losanálisis por PCR confirmaron la presencia de este gen en Rhizobium meliloti 1021 pero se observó un bajo nivel de expresión. La presencia del plásmido recombinante no afectó la capacidad nodulativa nide crecimiento de las plantas inoculadas. La presencia de proteíans tóxicas con actividad citolítica y hemolítica es unacaracterística de Bacillus thuringiensis entre este grupo la primeradescubierta fue Cyt1 la citolisina de Bacillus thuringienisis israelensis (Bti) (Earp, D. J., et al. 1987, Ward, E. S., et al. 1984). En esta subespecie hemos detectado la presencia de otro gen cyt, altamentehomólogo a la citolisina de 29 KDa, Cyt2 de la subespecie kyushuensis (Drobniewski, F, A., et al. 1989. Knowles, B, H. et al. 1992). Este gen mapea “río arriba “ del gen cry4B en el megaplásmido de 72 Md de la cepa 4Q2-72. Elanálisis de la secuencia reveló una región 5' estabilizadora del mARN similara las descriptas para otros genes cry. Los análisis de Western blot revelaronla presencia de un polipéptido inmunoreactivo en Bacillus thuringiensissubespecie 1884 y 4Q2-72. Mediante experimentos de PCR y de Southern blotse confirmó la presencia de este gen en otras subespecies mosquitocidas de Bacillus thuringiensis. Notablemente la subespecie tenebrionis que clasificadentro del serotipo morrisoni, con actividad tóxica para coleóptero, tambiénlleva este gen. Por otro lado, se obtuvieron resultados negativos con las cepastóxicas para lepidóptero kurstaki HD-l y aizawai HD-137. Así como los genes cry, que codifican toxinas larvicidas en Bacillusthuringiensis, los genes cyt también parecen constituir una amplia y diversafamilia de genes altamente relacionados.La presencia de hemolisinas Cyt hasido asociada típicamente con cepas de Bacillus thuringiensis con diferentepatotipo(Chang, C., et al. 1993; Crickmore, N., et al. 1995). Este es el caso delserotipo morrisoni el cual incluye cepas bilógicamente activas contra larvasde lepidóptero y coleóptero. Mientras que las proteínas Cyt fueron encontradas en la mayoría de las cepasmosquitocidas estudiadas, es probable que más de una citolisina coexista enlas cepas más tóxicas para dípteros, como las subespecies israelensis ymorrisoni PG14, sugiriendo esto una correlación entre la potenciamosquitocida y la actividad hemolítica. La secuencia parcial de diferentes genes cyt de cepas mosquitocidas y nomosquitocidas fue determinada y en base a estos datos se construyó un árbolfiligenético. , Nuestros encuentros sugieren que las proteínas Cyt tienen un espectro dedistribución más amplio que el que hasta ahora se conocía y probablementetambién de actividad contra insectos. Teniendo en cuenta las diferencias en elmecanismo de acción entre las proteínas Cry y Cyt se sugiere que éstasúltimas pueden ser un factor importante en el manejo de la resistenciadesarrollado por los insectos a toxinas Cry . Finalmente se sugiere que la actividad biológica de los cristales intactos demuchas subespecies de Bacillus thuringiensis puede ser considerada como laresultante de una compleja interacción entre las toxinas Cry y Cyt. |
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