Aspectos básicos y aplicados de la genética molecular de Bacillus thuringiensis

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Los inoculantes basados en Rhizobium son ampliamente usados en plantasluguminosas. Actualmente cepas bacterianas con funciones duales (porejemplo: fijación de nitrógeno y actividad insecticida) pueden ser unaalternativa para el manejo orgánico de pestes de insectos (Madhavi et al., 1993 and 1994). T...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Guerchicoff Lemcke, Alejandra
Formato: Tesis Doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 1999
Materias:
BACILLUS THURINGIENSIS
BACTERIAS FIJADORAS DE INTROGENO
GENES LARVICIDAS
GENES HEMOLITICOS
B. THURINGIENSIS
ENTOMOCIDAL GENES
HEMOLYTIC GENES
NITROGEN FIXING
RHIZOBIUM
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3106_GuerchicoffLemcke
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description Los inoculantes basados en Rhizobium son ampliamente usados en plantasluguminosas. Actualmente cepas bacterianas con funciones duales (porejemplo: fijación de nitrógeno y actividad insecticida) pueden ser unaalternativa para el manejo orgánico de pestes de insectos (Madhavi et al., 1993 and 1994). También pueden ser usadas para proteger semillas,reduciendo el uso de insecticidas químicos. El gen cry 4B de B. thuringiensisisraelensis que codifica para una proteína tóxica para díptero fue usado comomodelo. Para introducir dicho gen se usó el plásmido pTR101, un vectoraltamente estable, en Rhizobium en ausencia de presión de selección. Lasconstrucciones fueron introducidas en Rhizobium fredii 191 y Rhizobiummeliloti 1021, mediante conjugación tripartita con un plásmido ayudante. La expresión fue estudiada mediante Western blot de extractos crudosutilizando un anticuerpo específico contra la proteína Cry4B recombinante. Seobservaron reareglos que dieron lugar a deleciones, pero a pesar de esto unpolipéptido reactivo se detectó en ambos Rhizobios. Dado que en Argentina muchas pestes de coleópteros y nematodosconstituyen un serio problema para cultivos de alfalfa y soja, entre otros, elgen cry3A de B.thuringiensis tenebrionis (Krieg et al., 1983) fue introducidoen Rhizobium meliloti 1021. Se eligió al vector de amplio rango pRK404, paraevitar que se produzcan reareglos. Este plásmido posee un origen dereplicación derivado del RK2, lleva resistencia a kanamicina, puede sermovilizado con una alta frecuencia usando un plásmido ayudante. Losanálisis por PCR confirmaron la presencia de este gen en Rhizobium meliloti 1021 pero se observó un bajo nivel de expresión. La presencia del plásmido recombinante no afectó la capacidad nodulativa nide crecimiento de las plantas inoculadas. La presencia de proteíans tóxicas con actividad citolítica y hemolítica es unacaracterística de Bacillus thuringiensis entre este grupo la primeradescubierta fue Cyt1 la citolisina de Bacillus thuringienisis israelensis (Bti) (Earp, D. J., et al. 1987, Ward, E. S., et al. 1984). En esta subespecie hemos detectado la presencia de otro gen cyt, altamentehomólogo a la citolisina de 29 KDa, Cyt2 de la subespecie kyushuensis (Drobniewski, F, A., et al. 1989. Knowles, B, H. et al. 1992). Este gen mapea “río arriba “ del gen cry4B en el megaplásmido de 72 Md de la cepa 4Q2-72. Elanálisis de la secuencia reveló una región 5' estabilizadora del mARN similara las descriptas para otros genes cry. Los análisis de Western blot revelaronla presencia de un polipéptido inmunoreactivo en Bacillus thuringiensissubespecie 1884 y 4Q2-72. Mediante experimentos de PCR y de Southern blotse confirmó la presencia de este gen en otras subespecies mosquitocidas de Bacillus thuringiensis. Notablemente la subespecie tenebrionis que clasificadentro del serotipo morrisoni, con actividad tóxica para coleóptero, tambiénlleva este gen. Por otro lado, se obtuvieron resultados negativos con las cepastóxicas para lepidóptero kurstaki HD-l y aizawai HD-137. Así como los genes cry, que codifican toxinas larvicidas en Bacillusthuringiensis, los genes cyt también parecen constituir una amplia y diversafamilia de genes altamente relacionados.La presencia de hemolisinas Cyt hasido asociada típicamente con cepas de Bacillus thuringiensis con diferentepatotipo(Chang, C., et al. 1993; Crickmore, N., et al. 1995). Este es el caso delserotipo morrisoni el cual incluye cepas bilógicamente activas contra larvasde lepidóptero y coleóptero. Mientras que las proteínas Cyt fueron encontradas en la mayoría de las cepasmosquitocidas estudiadas, es probable que más de una citolisina coexista enlas cepas más tóxicas para dípteros, como las subespecies israelensis ymorrisoni PG14, sugiriendo esto una correlación entre la potenciamosquitocida y la actividad hemolítica. La secuencia parcial de diferentes genes cyt de cepas mosquitocidas y nomosquitocidas fue determinada y en base a estos datos se construyó un árbolfiligenético. , Nuestros encuentros sugieren que las proteínas Cyt tienen un espectro dedistribución más amplio que el que hasta ahora se conocía y probablementetambién de actividad contra insectos. Teniendo en cuenta las diferencias en elmecanismo de acción entre las proteínas Cry y Cyt se sugiere que éstasúltimas pueden ser un factor importante en el manejo de la resistenciadesarrollado por los insectos a toxinas Cry . Finalmente se sugiere que la actividad biológica de los cristales intactos demuchas subespecies de Bacillus thuringiensis puede ser considerada como laresultante de una compleja interacción entre las toxinas Cry y Cyt.
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Lasconstrucciones fueron introducidas en Rhizobium fredii 191 y Rhizobiummeliloti 1021, mediante conjugación tripartita con un plásmido ayudante. La expresión fue estudiada mediante Western blot de extractos crudosutilizando un anticuerpo específico contra la proteína Cry4B recombinante. Seobservaron reareglos que dieron lugar a deleciones, pero a pesar de esto unpolipéptido reactivo se detectó en ambos Rhizobios. Dado que en Argentina muchas pestes de coleópteros y nematodosconstituyen un serio problema para cultivos de alfalfa y soja, entre otros, elgen cry3A de B.thuringiensis tenebrionis (Krieg et al., 1983) fue introducidoen Rhizobium meliloti 1021. Se eligió al vector de amplio rango pRK404, paraevitar que se produzcan reareglos. Este plásmido posee un origen dereplicación derivado del RK2, lleva resistencia a kanamicina, puede sermovilizado con una alta frecuencia usando un plásmido ayudante. Losanálisis por PCR confirmaron la presencia de este gen en Rhizobium meliloti 1021 pero se observó un bajo nivel de expresión. La presencia del plásmido recombinante no afectó la capacidad nodulativa nide crecimiento de las plantas inoculadas. La presencia de proteíans tóxicas con actividad citolítica y hemolítica es unacaracterística de Bacillus thuringiensis entre este grupo la primeradescubierta fue Cyt1 la citolisina de Bacillus thuringienisis israelensis (Bti) (Earp, D. J., et al. 1987, Ward, E. S., et al. 1984). En esta subespecie hemos detectado la presencia de otro gen cyt, altamentehomólogo a la citolisina de 29 KDa, Cyt2 de la subespecie kyushuensis (Drobniewski, F, A., et al. 1989. Knowles, B, H. et al. 1992). Este gen mapea “río arriba “ del gen cry4B en el megaplásmido de 72 Md de la cepa 4Q2-72. Elanálisis de la secuencia reveló una región 5' estabilizadora del mARN similara las descriptas para otros genes cry. Los análisis de Western blot revelaronla presencia de un polipéptido inmunoreactivo en Bacillus thuringiensissubespecie 1884 y 4Q2-72. Mediante experimentos de PCR y de Southern blotse confirmó la presencia de este gen en otras subespecies mosquitocidas de Bacillus thuringiensis. Notablemente la subespecie tenebrionis que clasificadentro del serotipo morrisoni, con actividad tóxica para coleóptero, tambiénlleva este gen. Por otro lado, se obtuvieron resultados negativos con las cepastóxicas para lepidóptero kurstaki HD-l y aizawai HD-137. Así como los genes cry, que codifican toxinas larvicidas en Bacillusthuringiensis, los genes cyt también parecen constituir una amplia y diversafamilia de genes altamente relacionados.La presencia de hemolisinas Cyt hasido asociada típicamente con cepas de Bacillus thuringiensis con diferentepatotipo(Chang, C., et al. 1993; Crickmore, N., et al. 1995). Este es el caso delserotipo morrisoni el cual incluye cepas bilógicamente activas contra larvasde lepidóptero y coleóptero. Mientras que las proteínas Cyt fueron encontradas en la mayoría de las cepasmosquitocidas estudiadas, es probable que más de una citolisina coexista enlas cepas más tóxicas para dípteros, como las subespecies israelensis ymorrisoni PG14, sugiriendo esto una correlación entre la potenciamosquitocida y la actividad hemolítica. La secuencia parcial de diferentes genes cyt de cepas mosquitocidas y nomosquitocidas fue determinada y en base a estos datos se construyó un árbolfiligenético. , Nuestros encuentros sugieren que las proteínas Cyt tienen un espectro dedistribución más amplio que el que hasta ahora se conocía y probablementetambién de actividad contra insectos. Teniendo en cuenta las diferencias en elmecanismo de acción entre las proteínas Cry y Cyt se sugiere que éstasúltimas pueden ser un factor importante en el manejo de la resistenciadesarrollado por los insectos a toxinas Cry . Finalmente se sugiere que la actividad biológica de los cristales intactos demuchas subespecies de Bacillus thuringiensis puede ser considerada como laresultante de una compleja interacción entre las toxinas Cry y Cyt. Rhizobium-based inoculants are widely used in leguminous crops. Improvedstrains with dual functions (i.e, nitrogen fixing and insecticidal) could besuccessfully applied to organic pest management (Madhavi et al., 1993 and 1994). They could also be used as seed protectants, reducing the use ofchemical insecticides. The cry4B gene from B. thuringiensis israelensis codingfor an anti-dipteran toxin (Goldberg, L., 1977) was used as a model forexpression. A highly stable plasmid vector (pTR101) was chosen in order tointroduce insecticidal genes in Rhizobium in the absence of selective pressure. Constructions were introduced into Rhizobium fredii 191 and Rhizobiummeliloti 1021, through triparental matings with a helper plasmid. Expression was monitored by Western blotting of crude extracts using aspecific antibody raised against recombinant Cry4B protein. Althoughrearrangements leading to deletions were observed, an immunoreactivepolypeptide was reproducibly detected in both Rhizobia. Considering that pests such as Coleoptera in alfalfa or Nematoda in soybeanconstitute a serious problem in Argentina, the cry3A gene from B.thuringiensis tenebrionis (Krieg et al., 1983) was also introduced into Rhizobium meliloti 1021, in order to produce strains with anti-coleopteranactivity. A broad host range cloning sistem vector, pRK404, was chosen asalternative vector in order to prevent rearrangements. The tetracycline-resistantplasmid component of this system, pRK404, contains a functional RK2 replicon and can be mobilized at high frequency by using a helperplasmid, but is non-self-transmisible. PCR amplification analysis confirmedthe presence of this gene in Rhizobium meliloti 1021, low level of expressionwas observed. The presence of the recombinant plasmids did not affect either thenodulativen capacity or the growth of the inoculated plants. Mosquitocidal Bacillus thuringienisis strains show as a common feature, thepresence of toxic proteins with cytolytic and hemolytic activities, being Cyt1the characteristic cytolytic toxin of Bacillus thuringienisis israelensis (Bti) (Earp, D. J., et al. 1987, Ward, E. S., et al. 1984) In this species we have detected the presence of another cyt gene, highlyhomologous to cyt2, that codes for the 29 kDa cytolytic toxin from kyushuensissubspecies (Drobniewski, F, A., et al. 1989. Knowles, B, H. et al. 1992). Thisgene maps upstream cry4B, on the 72 Md plasmid of strain 4Q2. Sequenceanalysis revealed, as remarkable feature a 5’ mRNA stabilizing regionsimilar to those described for other cry genes. As predicted by sequenceanalysis, Western blot reveal Cyt2 cross recating polypeptides in 4Q2 and Bti 1884. PCR amplification and Southern blot analysis confirmed the presenceof this gene in other mosquitocidal subspecies. Interestingly, the anti-Coleopteransubspecies tenebrionis belonging to the morrisoni serotype, alsoshowed this gene. On the other hand, negative results were obtained with theanti-Lepidopteran subspecies kurstaki HD-l and aizawai HD-137. As is the case with cry genes, coding for larvicidal delta endotoxins, in Bacillus thuringienisis, the cyt genes for hemolytic toxins seem to form a largeand diverse family of highly related genes. The occurrence of Cyt hemolytic toxins has been tipically associated with thehost range of Bacillus thuringienisis strains of different pathotypes. This isthe case for the morrisoni serovar, that includes strains biologically activeagainst both lepidopteran and coleopteran larvae. While Cyt proteins occur in almost all the mosquitocidal strains studied, itseems that more than one Cyt toxin coexist in highly toxic antidipteranstrains, like Bacillus thuringienisis israelensis and morrisoni PG14,suggesting'a correlation betweeen mosquitocidal power and hemolitic activity. Partial DNA sequence for different cyt genes from mosquitocideal and nomosquitocidal strains were determined and a phyologenetic tree wasconstructed. This novel finding suggests that Cyt protein may have an even broaderspectrum of distribution and probably of activity against insects and, owing totheir different mechanism of action in comparation to Cry proteins, theymight be useful in managing resistance to Cry toxins. These findings suggest that the biological activity of the parasporal cristal ofmany Bacillus thuringienisis strains, should be viewed as the result of acomplex overall interaction between Cry and Cyt toxins. Fil: Guerchicoff Lemcke, Alejandra. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 1999 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3106_GuerchicoffLemcke

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