Modulación de oncogenes en cancer mamario humano

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El cáncer de mama es el tumor más frecuente en el sexo femenino afectando en la actualidad a una de cada diez mujeres. La complejidad de esta patología y el escaso conocimiento acerca de su etiología y desarrollo dificultan el entendimiento fisiopatológico de dicho desorden y, por consiguiente, la p...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Mladovan, Alejandro G.
Formato:	Tesis Doctoral
Lenguaje:	Español
Publicado:	1996
Materias:	ONCOGENES C-FOS C-MYC EGF ESTERES DE FORBOL TGF BETA CANCER DE MAMA LINEAS CELULARES PROLIFERACION MCF-10A MCF-10T PHORBOL ESTERS BREAST CANCER CELL GROWTH CELL LINES
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2837_Mladovan
Aporte de:	Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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description	El cáncer de mama es el tumor más frecuente en el sexo femenino afectando en la actualidad a una de cada diez mujeres. La complejidad de esta patología y el escaso conocimiento acerca de su etiología y desarrollo dificultan el entendimiento fisiopatológico de dicho desorden y, por consiguiente, la prevención y el tratamiento. Los estudios diferenciales sobre la proliferación y los mecanismos moleculares involucrados en los procesos de duplicación celular en células normales y neoplásicas aportan nuevas ideas para la comprensión del desarrollo de esta enfermedad. En tal sentido, los trabajos realizados en la presente Tesis tuvieron como principal objetivo estudiar diversos par metros involucrados en la proliferación de células mamarias humanas bajo la acción de hormonas peptídicas y de agentes que actúan como promotores tumorales. De la amplia gama de señales moleculares se analizaron especialmente aquellas relacionadas con la expresión de proto-oncogenes nucleares y la activación de ciertas kinasas que participan en la vía de señales que regulan la expresión de dichos genes. Estos estudios se realizaron utilizando como modelo de trabajo diversas líneas celulares, principalmente la línea no tumorigénica establecida a partir de tejido mamario humano normal, MCF-10A, su contraparte transformada con el oncogén H-ras, MCF-10T y líneas neoplásicas de mama humana ampliamente descriptas en la literatura como MCF-7, MDA-453 y SKBR3. La caracterización celular y molecular de MCF-10T evidenció la presencia de un gen H-ras mutado en el codón 12 y la sobre-expresión de dicho gen. Si bien se comprobó que MCF-10T es capaz de proliferar en forma independiente del anclaje, su duplicación es inhibida por la alta densidad celular siendo incapaz de proliferar en forma estratificada. Las células provenientes de tejido normal evidenciaron una tasa proliferativa mayor que las de origen neoplásico en condiciones de cultivo favorable, mientras que células no transformadas como las MCF-10A no sobreviven en ausencia de nutrientes. De los agentes que promueven la proliferación en células MCF-10, el EGF ejerció un potente efecto mitogénico seguido por el IGF-I y la insulina a altas dosis. Los estudios determinaron que en estas células el EGF y el PMA, pero no la insulina o el IGF-I, son capaces de aumentar los niveles de ARNm del gen c-fos. Los estudios demostraron que el EGF y el PMA inducen la expresión de los proto-oncogenes c-fos, c-jun, fosB y junB con cinéticas particulares para cada gen no mostrando diferencias significativas entre las células MCF-10A y MCF-10T, siendo válida esta observación para los dos agentes analizados. Otros genes como c-myc, junD o fra1, evidenciaron escasa variación en sus niveles de transcriptos ante dichos estímulos. Si bien ambas líneas exhibieron una dosis dependencia del EGF en cuanto a su proliferación, inducción de la síntesis de ADN y expresión de proto-oncogenes nucleares, la línea transformada MCF-10T manifestó un menor requerimiento de nutrientes y una mayor sensibilidad a otros mitógenos comparado con MCF-10A, posiblemente debido a una mayor proliferación autócrina. La combinación del EGF con otros agentes estudiados promueve un mayor efecto proliferativo que el ejercido por cada uno de ellos individualmente sin afectar los niveles de transcriptos de proto-oncogenes nucleares inducidos por el EGF. Se comprobó que el EGF ejerce su acción inductora sobre los proto-oncogenes nucleares a través de la autofosforilación de su receptor específico con la subsecuente activación de MAP kinasas involucradas en la cascada de señales mitogénicas. Se observó además, que las diversas líneas celulares analizadas difieren cuantitativamente en los tipos de MAP kinasas que expresan según su origen normal o neoplásico. Esto establece un hecho relevante por cuanto podría inferirse que tales especies constituyen marcadores específicos de desórdenes asociados al tipo de neoplasia analizado. Si bien la acción de agentes que inducen la formación del segundo mensajero AMPc resultan inhibitorios de la proliferación en ciertas líneas celulares de mama, en ningún caso estos agentes, o drogas que mimetizan la acción del AMPc, bloquearon la activación de MAP kinasas mediada por el EGF como se ha descripto en otros sistemas celulares. Por último, el gen c-myc, cuyos transcriptos se encuentran elevados en las células MCF-10A y MCF-10T durante su crecimiento exponencial o en estadio de aquiescencia, no solo es regulado por agentes mitogénicos como el EGF, sino también por las condiciones extracelulares (densidad celular y factores de crecimiento autócrinos) y por agentes inhibitorios de la proliferación como el TGFb1. Por lo tanto se ha demostrado que la transformación in vitro de células de mama normales por el oncogén H-ras, a diferencia de lo que ocurre en otros modelos celulares, altera en forma pleiotrópica diversas funciones celulares relacionadas con el proceso neoplásico, como el crecimiento en ausencia de sustrato de anclaje, requerimiento de nutrientes y diversos cambios morfológicos, sin afectar ciertos mecanismos involucrados en la respuesta primaria que conducen a la duplicación celular como la inducción de proto-oncogenes nucleares o la activación de la vía de MAP kinasas. Asimismo, se deduce que el proceso neoplásico difícilmente pueda ser atribuido a la alteración de un solo gen; resulta más adecuado sugerir que tales desórdenes son consecuencia de un número mayor de fenómenos que actúan en forma coordinada para desarrollar todo su potencial neoplásico. Es mi más firme deseo que los estudios detallados en esta Tesis puedan contribuir de alguna forma al entendimiento de la patogenia y el desarrollo de las enfermedades neoplásicas que afectan al ser humano.
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En tal sentido, los trabajos realizados en la presente Tesis tuvieron como principal objetivo estudiar diversos par metros involucrados en la proliferación de células mamarias humanas bajo la acción de hormonas peptídicas y de agentes que actúan como promotores tumorales. De la amplia gama de señales moleculares se analizaron especialmente aquellas relacionadas con la expresión de proto-oncogenes nucleares y la activación de ciertas kinasas que participan en la vía de señales que regulan la expresión de dichos genes. Estos estudios se realizaron utilizando como modelo de trabajo diversas líneas celulares, principalmente la línea no tumorigénica establecida a partir de tejido mamario humano normal, MCF-10A, su contraparte transformada con el oncogén H-ras, MCF-10T y líneas neoplásicas de mama humana ampliamente descriptas en la literatura como MCF-7, MDA-453 y SKBR3. La caracterización celular y molecular de MCF-10T evidenció la presencia de un gen H-ras mutado en el codón 12 y la sobre-expresión de dicho gen. Si bien se comprobó que MCF-10T es capaz de proliferar en forma independiente del anclaje, su duplicación es inhibida por la alta densidad celular siendo incapaz de proliferar en forma estratificada. Las células provenientes de tejido normal evidenciaron una tasa proliferativa mayor que las de origen neoplásico en condiciones de cultivo favorable, mientras que células no transformadas como las MCF-10A no sobreviven en ausencia de nutrientes. De los agentes que promueven la proliferación en células MCF-10, el EGF ejerció un potente efecto mitogénico seguido por el IGF-I y la insulina a altas dosis. Los estudios determinaron que en estas células el EGF y el PMA, pero no la insulina o el IGF-I, son capaces de aumentar los niveles de ARNm del gen c-fos. Los estudios demostraron que el EGF y el PMA inducen la expresión de los proto-oncogenes c-fos, c-jun, fosB y junB con cinéticas particulares para cada gen no mostrando diferencias significativas entre las células MCF-10A y MCF-10T, siendo válida esta observación para los dos agentes analizados. Otros genes como c-myc, junD o fra1, evidenciaron escasa variación en sus niveles de transcriptos ante dichos estímulos. Si bien ambas líneas exhibieron una dosis dependencia del EGF en cuanto a su proliferación, inducción de la síntesis de ADN y expresión de proto-oncogenes nucleares, la línea transformada MCF-10T manifestó un menor requerimiento de nutrientes y una mayor sensibilidad a otros mitógenos comparado con MCF-10A, posiblemente debido a una mayor proliferación autócrina. La combinación del EGF con otros agentes estudiados promueve un mayor efecto proliferativo que el ejercido por cada uno de ellos individualmente sin afectar los niveles de transcriptos de proto-oncogenes nucleares inducidos por el EGF. Se comprobó que el EGF ejerce su acción inductora sobre los proto-oncogenes nucleares a través de la autofosforilación de su receptor específico con la subsecuente activación de MAP kinasas involucradas en la cascada de señales mitogénicas. Se observó además, que las diversas líneas celulares analizadas difieren cuantitativamente en los tipos de MAP kinasas que expresan según su origen normal o neoplásico. Esto establece un hecho relevante por cuanto podría inferirse que tales especies constituyen marcadores específicos de desórdenes asociados al tipo de neoplasia analizado. Si bien la acción de agentes que inducen la formación del segundo mensajero AMPc resultan inhibitorios de la proliferación en ciertas líneas celulares de mama, en ningún caso estos agentes, o drogas que mimetizan la acción del AMPc, bloquearon la activación de MAP kinasas mediada por el EGF como se ha descripto en otros sistemas celulares. Por último, el gen c-myc, cuyos transcriptos se encuentran elevados en las células MCF-10A y MCF-10T durante su crecimiento exponencial o en estadio de aquiescencia, no solo es regulado por agentes mitogénicos como el EGF, sino también por las condiciones extracelulares (densidad celular y factores de crecimiento autócrinos) y por agentes inhibitorios de la proliferación como el TGFb1. Por lo tanto se ha demostrado que la transformación in vitro de células de mama normales por el oncogén H-ras, a diferencia de lo que ocurre en otros modelos celulares, altera en forma pleiotrópica diversas funciones celulares relacionadas con el proceso neoplásico, como el crecimiento en ausencia de sustrato de anclaje, requerimiento de nutrientes y diversos cambios morfológicos, sin afectar ciertos mecanismos involucrados en la respuesta primaria que conducen a la duplicación celular como la inducción de proto-oncogenes nucleares o la activación de la vía de MAP kinasas. Asimismo, se deduce que el proceso neoplásico difícilmente pueda ser atribuido a la alteración de un solo gen; resulta más adecuado sugerir que tales desórdenes son consecuencia de un número mayor de fenómenos que actúan en forma coordinada para desarrollar todo su potencial neoplásico. Es mi más firme deseo que los estudios detallados en esta Tesis puedan contribuir de alguna forma al entendimiento de la patogenia y el desarrollo de las enfermedades neoplásicas que afectan al ser humano. Breast cancer is the most frequent female tumor affecting at present one out of ten women. The complexity of this pathology and our limited knowledge of its etiology and biology hinder the understanding, prevention and treatment of the disease. Studies on the proliferation and molecular mechanisms involved in cell division from both normal and neoplastic cell lines would contribute with new insights in the the development of this affliction. In this sense, the aim of this Thesis was to study several parameters involved in the proliferation of human mammary cells exposed in culture to peptide hormones and tumor promoters. Among the broad range of molecular signals, those involved with the expression of proto-oncogenes and related kinases that regulates this process, were analyzed. These studies were carried out on several cell lines, namely MCF-10A, established from normal human breast tissue; MCF-10T, the same line transformed with an H-ras oncogene and several well-known neoplastic human breast cell lines: MCF-7, MDA-453 and SKBR3. The cellular and molecular characterization of MCF-10T showed the presence of the H-ras gene mutated in codon 12 and its overexpression. Although MCF-10T is capable of anchorage-independent growth, its duplication is inhibited by high cell density and cannot proliferate in a stratified fashion. Cells from normal tissue displayed a higher growth rate than those from neoplastic sources in a suitable culture condition, but non-tumorigenic cells, as MCF-10A cannot survive in the absence of appropriate growth factors. From the proliferating agents studied on MCF-10A and MCF-10T cells, EGF exerted the most potent mitogenic effect, followed by IGF-I and insulin at high dose. Both EGF and PMA, but neither IGF-I nor insulin, were able to modify c-fos mRNA levels. Studies demonstrated that EGF and PMA induced the expression of c-fos, c-jun, fosB and junB with a particular kinetic for each gene without any significant differences between MCF-10A and MCF-10T nor among EGF and PMA. Other genes, such as c-myc, junD or fra-1 showed only a poor variation in its transcript levels with those stimuli. Although growth rate, DNA synthesis and proto-oncogene induction were dependent on the EGF concentration in both lines, the transformed MCF-10T cell line exhibited a lower requirement for nutrients and an increased sensitivity to other mitogens, probably due to an autocrine proliferation. The association of EGF with other agents increased the proliferative effect exerted by each agent alone, without affecting the proto-oncogene mRNA levels induced by EGF. EGF exerts its action on nuclear proto-oncogenes through autophosphorylation of its specific receptor with the subsequent activation of MAP kinases. Each cell line expressed different classes of MAP kinases, according to their normal or neoplastic origin. This constitutes a significant finding, as it could be inferred that such species make up specific markers associated to the type of neoplasia analyzed. Though cAMP inducing agents inhibit proliferation of certain mammary cell lines, this action is not mediated through the control of MAP kinase activity as it was widely described in other systems. c-myc gene, whose transcripts are elevated in both proliferating and quiescent MCF-10 cells, is regulated by mitogens such as EGF and also by extracellular conditions (cellular density and autocrine factors) and TGF(1, an inhibitor of cell growth. Thus, in vitro transformation of breast cells with an activated H-ras gene alters in a pleiotropic mode several cellular functions associated to the neoplastic process, such as independent-anchorage growth, nutrient requirement and morphological changes. However, it does not affect those mechanisms involved in the early responses which trigger cell duplication, such as the induction of nuclear proto-oncogenes or activation of MAP kinases. Therefore, these results suggest that the neoplastic process cannot be attributed to the alteration of only one gene; instead, it would be more adequate to consider this disease as a consequence several events acting in coordination to fulfill their neoplastic potential. I hope the studies analyzed in this Thesis could contribute in part to the understanding of the pathogenesis and development of the neoplastic disease affecting the human being. Fil: Mladovan, Alejandro G.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 1996 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2837_Mladovan

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