Actividad biológica de antígenos de Trypanosoma cruzi

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De acuerdo a los objetivos planteados en este trabajo, hemos investigado laasociación entre componentes subcelulares del parásito con el gatillado y/odesarrollo del daño tisular en la forma crónica de la Enfermedad de Chagas. Nuestro primer paso fue investigar los componentes de la fracción CSrespon...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Laucella, Susana Adriana
Formato: Tesis Doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 1994
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2698_Laucella
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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Si bienno pudo determinarse un perfil de reconocimiento particular para los PChCr condistinto compromiso clínico, se observó que el 75 % de los sueros reconocía 2polipéptidos con PM aparente de 52 y 42/42 kDa. En un segundo momento intentamos una caracterización química inicial delas estructuras peptídicas antigénicas de CS y Mc. El tratamiento con ácidoperiódico disminuyó significativamente la reactividad de los sueros contra ambasfracciones, indicando el rol central de los carbohidratos en su antigenicidad. Eltratamiento de CS con tripsina eliminó prácticamente toda la reactividad con lossueros de PChCr. El calentamiento y la reducción con 2 ME aunque tambiénredujeron la capacidad total de unión de los anticuerpos hacia CS y Mc, el efectofue más pronunciado para Mc. Sin embargo estos estudios revelaron que elantígeno calentado y reducido se resuelve en un mayor número de polipéptidosque el antígeno nativo, o solamente calentado o reducido. Con el objetivo de purificar antígenos relevantes se produjeron AcMo contra Mc. La reactividad anti-Mc y anti-CS de dichos AcMo fue evaluada empleandotécnicas de ELISA, dot blotting (DB) e inmunoblotting (WB). Se seleccionaron así 45hibridomas reactivos con Mc (28), Mc y CS (14) y CS (3). Entre los hibridomasproductores de anticuerpos capaces de reconocer en Mc al menos un polipéptidocon PM aparente mayor o igual a 50 kDa se seleccionaron 4 para su clonado. Deestos 4 AcMo, todos del tipo IgM, fue posible aislar un total de 24 clones: 3 a partirdel hibridoma 1A10, 12 a partir de 1D10, 2 a partir de 3C4 y 7 a partir de 2E9, lamayoría de los cuales se mostró reactivo con varios polipéptidos (3 a 9) en el mismogel. Si bien el rendimiento de los procesos de clonado fue diverso, de 2 a 23 clonesproductores de AcMo reactivos con Mc según el hibridoma de partida, la eficacia delclonado fue buena: en 3 de los 4 casos fue posible identificar y aislar clonesproductores de Ac reactivos con polipéptidos del tamaño buscado, y en todos estoscasos con reactividad más restringida que la del hibridoma original. A fin de investigar la presencia de determinantes antigénicos comunes al T. cruzi y a tejidos humanos se estudió la reactividad de los AcMo con muestras detejidos humanos, obtenidas a partir de dadores cadavéricos no chagásicos, libresde enfermedades autoinmunes, coronarias y tumorales. Empleando ensayos de DBse estudió la reactividad anti-miocardio (MIO) y anti-músculo esquelético (MES) de 52 sobrenadantes de hibridomas reactivos con Mc y/o CS y 11 sobrenadantesnegativos con ambas fracciones. En este primer estudio 27 de los 52 sobrenadantesde hibridomas reactivos con Mc y/o CS resultaron reactivos con MIO y/o MES. Conel propósito de establecer el perfil polipeptídico de MIO y MES humano amboshomogenatos fueron separados utilizando geles desnaturalizantes depoliacrilamida y transferidos a nitrocelulosa. Una porción de la misma se coloreócon Negro de Amido para evidenciar proteínas y la otra porción se aplicó a ladeterminación de glicoproteínas con Concanavalina A, para identificar residuoshidrocarbonados ricos en manosa y glucosa. MIO presentó 25 polipéptidos en elrango 79-15 kDa, 6 de los cuales contenían residuos azucarados, mientras MESreveló 24 bandas polipeptídicas, 7 de las cuales contenían hidratos de carbono. Una vez definido el perfil de MIO y MES se realizaron ensayos de WB paraidentificar los polipéptidos reconocidos por los AcMo en ellos. La fracción Mc es obtenida a partir de parásitos cultivados en un medio nodefinido que contiene homogeneizado de corazón bovino (TCM). Es entoncesposible que componentes del medio de cultivo acompañen la purificación y hayan “ensuciado” la producción y selección de los AcMo, que así podrían incluiranticuerpos específicos para corazón bovino capaces de dar reacción cruzada conmiocardio humano. A fin de investigar esta posibilidad se determinó en primer lugarla reactividad de dichos AcMo contra TCM y en aquellos casos donde esta fueencontrada se realizaron experimentos de absorción cuyos resultados demostraronque si bien para algunos AcMo existe reactividad cruzada entre Mc y TCM, lareactividad de los mismos hacia TCM es despreciable frente a la reactividad hacia Mc. Con el propósito de determinar no sólo la presencia sino también lalocalización subcelular de los antígenos de MIO y MES humano reconocidos por los AcMo anti-Mc se realizaron experimentos de inmunohistoquímica. Además seevaluó la especificidad de huésped y tejido empleando tejidos humanos y dehamster. En particular los AcMo ensayados (1A10C11, 1F3G2, 5A9B11 y 5F2)reconocieron estructuras en el MES humano y en MIO humano y de hamster. Entodos los casos los AcMo se unen a antígenos intracitoplasmáticos, y en algunoscasos (5A9B11 y 5F2) también a antígenos de la capa muscular de los vasos. El hecho de haber demostrado reactividad contra M10 de hamster dejóabierta la posibilidad de estudiar la actividad biológica de los mismos en modelosexperimentales y por lo tanto consideramos importante estudiar el grado dehomología entre los componentes del miocardio de distintos mamíferos. El perfilpolipeptídico obtenido por la separación electroforética de homogenatos de MIOmostró un importante grado de homologia entre especies. Por otro lado la realización de ensayos de Inmunoiluorescencia sobreparásitos fijados mostró que los epitopos reconocidos por los AcMo, a pesar depertenecer originalmente a una fracción interna del parásito, están tambiénrepresentados en la superficie y/o el flagelo del mismo. Otros estudios decaracterización de los AcMo anti-Mc revelaron que gran parte de los epitoposreconocidos por los mismos son al menos parcialmente de naturaleza glucídica. Enparticular entre los AcMo con reactividad cruzada dos (1A10C11 y 1F3G2)reconocen parcialmente epitopos de naturaleza glucídica mientras en los dosrestantes (5A9B11 y 5F2) los residuos hidrocarbonados no forman parte del sitio reconocido. Para determinar si los epitopos con reactividad cruzada eran reconocidos porlos PChCr y evaluar se ello tiene alguna importancia desde el punto de vistabiológico, se realizaron ensayos de inhibición. La capacidad para inmunoinhibir lareacción del AcMo 5F2 con Mc fue significativamente mayor entre los sueros de PChCr que en los controles. Más aún, 5F2 fue capaz de diferenciar a la poblaciónde PChCr sin compromiso cardíaco, o con grado mínimo, de la de PChCr concompromiso cardiaco. Es también interesante destacar que la capacidad parainmunoinhibir la reacción de 5F2 resultó entre sueros de PChCr sin compromisocardíaco directamente proporcional a la edad de los pacientes. El AcMo 5A9B11también fue capaz de separar la población de PChCr de la de los controles. Másaún, los epitopos del 5A9B11 fueron reconocidos en distinta medida por los PChCrsin compromiso cardiaco, definiendose dos poblaciones con baja y alta capacidadde inmunoinhibición respectivamente. Por último, y atendiendo al rol central que las citoquinas y las moléculas deadhesión celular tienen en la modulación de la respuesta inmune, tanto en su fazprotectora como en su potencial faz autoagresiva, en este trabajo estudiamos lacinética de expresión endógena de genes para citoquinas e ICAM-1 en células debazo (B) y corazón (C) de ratones infectados con las cepas Tulahuén y CA-1 delparásito. Luego de obtener el ARN y ADNc a partir de homogenatos de B y C serealizaron ensayos de PCR cuali y cuantitativo usando "primers" y/o competidoresespecíficos para IFN γ, TNF α, IL α, IL-6 e ICAM-1, encontrándose que la infecciónpor el parásito va acompañada por un claro aumento en los niveles intracelularesde precursores para citoquinas e ICAM-1, aunque la cinética depende del órganoestudiado y de la naturaleza de los parásitos infectantes.
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spelling todo:tesis_n2698_Laucella2023-10-03T12:32:13Z Actividad biológica de antígenos de Trypanosoma cruzi Laucella, Susana Adriana De acuerdo a los objetivos planteados en este trabajo, hemos investigado laasociación entre componentes subcelulares del parásito con el gatillado y/odesarrollo del daño tisular en la forma crónica de la Enfermedad de Chagas. Nuestro primer paso fue investigar los componentes de la fracción CSresponsables de la respuesta inmune humoral en los PChCr y en particular,identificar aquellos que pudieren ser reconocidos exclusivamente por los PChCrcon cardiopatía severa. Para ello CS fue separada empleando geles depoliacrilamida, transferencia a hojas de nitrocelulosa y enfrentada con sueros de PChCr en distintos estadios clínicos. Estos estudios revelaron 32 componentesproteicos con PM entre 88 y 15 kDa, 30 de los cuales junto a 1 no visible por tinciónpara proteinas fueron reconocidos por al menos 1 de los 36 sueros ensayados,cada uno de los cuales reconoció entre 4 y 20 (media=12.6) bandas en CS. Si bienno pudo determinarse un perfil de reconocimiento particular para los PChCr condistinto compromiso clínico, se observó que el 75 % de los sueros reconocía 2polipéptidos con PM aparente de 52 y 42/42 kDa. En un segundo momento intentamos una caracterización química inicial delas estructuras peptídicas antigénicas de CS y Mc. El tratamiento con ácidoperiódico disminuyó significativamente la reactividad de los sueros contra ambasfracciones, indicando el rol central de los carbohidratos en su antigenicidad. Eltratamiento de CS con tripsina eliminó prácticamente toda la reactividad con lossueros de PChCr. El calentamiento y la reducción con 2 ME aunque tambiénredujeron la capacidad total de unión de los anticuerpos hacia CS y Mc, el efectofue más pronunciado para Mc. Sin embargo estos estudios revelaron que elantígeno calentado y reducido se resuelve en un mayor número de polipéptidosque el antígeno nativo, o solamente calentado o reducido. Con el objetivo de purificar antígenos relevantes se produjeron AcMo contra Mc. La reactividad anti-Mc y anti-CS de dichos AcMo fue evaluada empleandotécnicas de ELISA, dot blotting (DB) e inmunoblotting (WB). Se seleccionaron así 45hibridomas reactivos con Mc (28), Mc y CS (14) y CS (3). Entre los hibridomasproductores de anticuerpos capaces de reconocer en Mc al menos un polipéptidocon PM aparente mayor o igual a 50 kDa se seleccionaron 4 para su clonado. Deestos 4 AcMo, todos del tipo IgM, fue posible aislar un total de 24 clones: 3 a partirdel hibridoma 1A10, 12 a partir de 1D10, 2 a partir de 3C4 y 7 a partir de 2E9, lamayoría de los cuales se mostró reactivo con varios polipéptidos (3 a 9) en el mismogel. Si bien el rendimiento de los procesos de clonado fue diverso, de 2 a 23 clonesproductores de AcMo reactivos con Mc según el hibridoma de partida, la eficacia delclonado fue buena: en 3 de los 4 casos fue posible identificar y aislar clonesproductores de Ac reactivos con polipéptidos del tamaño buscado, y en todos estoscasos con reactividad más restringida que la del hibridoma original. A fin de investigar la presencia de determinantes antigénicos comunes al T. cruzi y a tejidos humanos se estudió la reactividad de los AcMo con muestras detejidos humanos, obtenidas a partir de dadores cadavéricos no chagásicos, libresde enfermedades autoinmunes, coronarias y tumorales. Empleando ensayos de DBse estudió la reactividad anti-miocardio (MIO) y anti-músculo esquelético (MES) de 52 sobrenadantes de hibridomas reactivos con Mc y/o CS y 11 sobrenadantesnegativos con ambas fracciones. En este primer estudio 27 de los 52 sobrenadantesde hibridomas reactivos con Mc y/o CS resultaron reactivos con MIO y/o MES. Conel propósito de establecer el perfil polipeptídico de MIO y MES humano amboshomogenatos fueron separados utilizando geles desnaturalizantes depoliacrilamida y transferidos a nitrocelulosa. Una porción de la misma se coloreócon Negro de Amido para evidenciar proteínas y la otra porción se aplicó a ladeterminación de glicoproteínas con Concanavalina A, para identificar residuoshidrocarbonados ricos en manosa y glucosa. MIO presentó 25 polipéptidos en elrango 79-15 kDa, 6 de los cuales contenían residuos azucarados, mientras MESreveló 24 bandas polipeptídicas, 7 de las cuales contenían hidratos de carbono. Una vez definido el perfil de MIO y MES se realizaron ensayos de WB paraidentificar los polipéptidos reconocidos por los AcMo en ellos. La fracción Mc es obtenida a partir de parásitos cultivados en un medio nodefinido que contiene homogeneizado de corazón bovino (TCM). Es entoncesposible que componentes del medio de cultivo acompañen la purificación y hayan “ensuciado” la producción y selección de los AcMo, que así podrían incluiranticuerpos específicos para corazón bovino capaces de dar reacción cruzada conmiocardio humano. A fin de investigar esta posibilidad se determinó en primer lugarla reactividad de dichos AcMo contra TCM y en aquellos casos donde esta fueencontrada se realizaron experimentos de absorción cuyos resultados demostraronque si bien para algunos AcMo existe reactividad cruzada entre Mc y TCM, lareactividad de los mismos hacia TCM es despreciable frente a la reactividad hacia Mc. Con el propósito de determinar no sólo la presencia sino también lalocalización subcelular de los antígenos de MIO y MES humano reconocidos por los AcMo anti-Mc se realizaron experimentos de inmunohistoquímica. Además seevaluó la especificidad de huésped y tejido empleando tejidos humanos y dehamster. En particular los AcMo ensayados (1A10C11, 1F3G2, 5A9B11 y 5F2)reconocieron estructuras en el MES humano y en MIO humano y de hamster. Entodos los casos los AcMo se unen a antígenos intracitoplasmáticos, y en algunoscasos (5A9B11 y 5F2) también a antígenos de la capa muscular de los vasos. El hecho de haber demostrado reactividad contra M10 de hamster dejóabierta la posibilidad de estudiar la actividad biológica de los mismos en modelosexperimentales y por lo tanto consideramos importante estudiar el grado dehomología entre los componentes del miocardio de distintos mamíferos. El perfilpolipeptídico obtenido por la separación electroforética de homogenatos de MIOmostró un importante grado de homologia entre especies. Por otro lado la realización de ensayos de Inmunoiluorescencia sobreparásitos fijados mostró que los epitopos reconocidos por los AcMo, a pesar depertenecer originalmente a una fracción interna del parásito, están tambiénrepresentados en la superficie y/o el flagelo del mismo. Otros estudios decaracterización de los AcMo anti-Mc revelaron que gran parte de los epitoposreconocidos por los mismos son al menos parcialmente de naturaleza glucídica. Enparticular entre los AcMo con reactividad cruzada dos (1A10C11 y 1F3G2)reconocen parcialmente epitopos de naturaleza glucídica mientras en los dosrestantes (5A9B11 y 5F2) los residuos hidrocarbonados no forman parte del sitio reconocido. Para determinar si los epitopos con reactividad cruzada eran reconocidos porlos PChCr y evaluar se ello tiene alguna importancia desde el punto de vistabiológico, se realizaron ensayos de inhibición. La capacidad para inmunoinhibir lareacción del AcMo 5F2 con Mc fue significativamente mayor entre los sueros de PChCr que en los controles. Más aún, 5F2 fue capaz de diferenciar a la poblaciónde PChCr sin compromiso cardíaco, o con grado mínimo, de la de PChCr concompromiso cardiaco. Es también interesante destacar que la capacidad parainmunoinhibir la reacción de 5F2 resultó entre sueros de PChCr sin compromisocardíaco directamente proporcional a la edad de los pacientes. El AcMo 5A9B11también fue capaz de separar la población de PChCr de la de los controles. Másaún, los epitopos del 5A9B11 fueron reconocidos en distinta medida por los PChCrsin compromiso cardiaco, definiendose dos poblaciones con baja y alta capacidadde inmunoinhibición respectivamente. Por último, y atendiendo al rol central que las citoquinas y las moléculas deadhesión celular tienen en la modulación de la respuesta inmune, tanto en su fazprotectora como en su potencial faz autoagresiva, en este trabajo estudiamos lacinética de expresión endógena de genes para citoquinas e ICAM-1 en células debazo (B) y corazón (C) de ratones infectados con las cepas Tulahuén y CA-1 delparásito. Luego de obtener el ARN y ADNc a partir de homogenatos de B y C serealizaron ensayos de PCR cuali y cuantitativo usando "primers" y/o competidoresespecíficos para IFN γ, TNF α, IL α, IL-6 e ICAM-1, encontrándose que la infecciónpor el parásito va acompañada por un claro aumento en los niveles intracelularesde precursores para citoquinas e ICAM-1, aunque la cinética depende del órganoestudiado y de la naturaleza de los parásitos infectantes. Fil: Laucella, Susana Adriana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 1994 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2698_Laucella

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