Carboxiquinasa fosfoenolpirúvica de levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae) : Aislamiento, purificación y propiedades

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Se ha estudiado la obtención a partir de la levadura depanaderia (Saccharomyces cerevisiae) de la enzima responsablede la fijación de anhídrido carbónico por dicho microorganismoy cuyas propiedades permiten clasificarla, de acuerdo a la nomenclaturaadoptada por Utter, como una carboxiquinasa fosfoen...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Cannata, Joaquín J. B.
Formato:	Tesis Doctoral
Lenguaje:	Español
Publicado:	1962
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n1123_Cannata
Aporte de:	Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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E) Fraccionamiento alcohólico en presencia de iones Ca^++recogiendo la fracción que cae entre 8.5 y 17% de concentraciónalcohólica (v/v). P) Precipitación con sulfato de amonio. Diálisis. G) Fraccionamiento alcohólico en presencia de iones Zn^++. H) Precipitación con sulfato de amonio. Diálisis. I) Cromatografía en columna de dietil amino etil celulosa (DEAE)(O alternativamente en columna de hidroxilapatita) J) Electroforesis de zona en columna de celulosa. La preparación final se comporta en los experimentos deelectroforesis libre y ultracentrifugación analítica como un sistemaaparentemente homogeneo. La enzima cataliza el intercambio de C^14 O2 con el carboxiloβ del oxalacetato a un pH óptimo cercano a 6.1 siendo lareacción dependiente de la presencia de ATP e iones Mn^++. En esascondiciones se pudo aislar oxalacetato radioactivo como 2-4 dinitrofenilhidrazona,la cual se identificó por cromatografía enpapel y radioautografía. La acción activadora que el ADP y elfosfoenolpiruvato ejercían sobre la reacción de intercambio sugirióque ambos compuestos podrian estar involucrados en lareacción de fijación, pero los primeros ensayos de carboxilacióndirecta del fosfoenolpiruvato realizados con extractos poco purificadosy en diversas condiciones experimentales fueron negativos. Ello recién fué posible llevando a cabo la reacción decarboxilación en presencia de la transaminasa aspártico-glutámicay glutamato o de la málico dehidrogenass y DPNH. En el primercaso utilizando C^14 O2 se pudo aislar y caracterizar por cromatografíaen papel y radioautografia, aspartato radioactivo yen el segundo caso se pudo seguir espectrofotometricamente elcurso de la reacción de oxidación del DPNH. La reacción de carboxilación del fosfoenolpiruvato requiere ADPe iones Mn^++ y tiene lugar a un pH óptimo de 5.4. El piruvatomas ATP no pueden reemplazar al fosfoenolpiruvato y ADP. La formación de ATP durante dicha reacción y la estequiometriade la mismase estudiaron utilizando un fosfoenolpiruvato marcadocon P^32 en el grupo fosfato y llevando a cabo la reacción enpresencia de C^14 O2. La determinación de las radioactividadescorrespondientes al ATP y oxalacetato formadas en esas condicionespermitió comprobar una estricta relación estequiométrica entreambas. La reacción es especifica para los polifosfatos de la adenosina,siendo la enzima inactiva con derivados de la guanosina,inosina, citidina y uridina ya sea en la fijación directa o enla de intercambio, en cambio los deoxiderivados de la adenosinaresultaron parcialmente activos. Si bien los extractos impuros presentan una parcial actividaden ausencia de cationes divalentes, los extractos altamentepurificados son sumamente dependientes de los mismos. El ion Mn^++ es el más activo de todos los cationes divalentes ensayados,siguiendole en importancia, el Zn^++, el Co^++, el Mg^++ y el Cd^++. Se estudió la influencia de la concentración de bicarbonatoen la reacción de carboxilación pudiéndose determinar la Km(C02) = 9.9 x 10^-3 M y la Km(CO3H^-) = 5 x 10^-3 M. Los reactivos de tioles ejercen acción inhibidora sobrela enzima. El p-cloromercuribenzoato fue el más efectivo puesen concentración 10^-4 M tuvouna acción inhibidora de casi el 100%.En esas condiciones la enzima puede ser reactivada parcialmentepor el glutation reducido, dependiendo el grado dereactivación de la duración del período previo de incubación dela enzima con el inhibidor. El melarsen fué menos efectivo (20%de inhibición con una concentración 0.66 x 10^-3 M). El iodosobenzoatoy la N-etilmaleimida en concentraciones 7 x 10^-4 y 5 x 10^-4 M respectivamente fueron inactivos. De los inhibidores de la asimilación de anhídrido carbónicopor la célula entera, que se ensayaron; 2-4 dinitrofenol,fluoruro y azida sódica, tan solo el último fue capaz de inhibiren forma significativa a la enzima. La enzima ejerce una marcada acción decarboxilante especificamentesobre el oxalacetato, siendo la reacción dependientede 1a presencia de concentraciones cataliticas de ATP, reemplazablepor ADP ó AMP y sus deoxi-derivados. Los otros nucleósidotrifosfatos ensayados carecen de acción activadora sobrela misma. Cuando la reacción se realiza en presencia de ATP, losproductos de la reacción son piruvato y fosfoenolpiruvato. Esteúltimo compuesto se identificó utilizando ATP marcado con P^32 en los grupos fosfatos ɣ y β y aislando un fosfoenolpiruvatoradicactivo. En los trabajos de rutina el fosfoenolpiruvatose determinó por el ortofosfato liberable por nitrato mercúrico. Con ADP ó AMP el fosfoenolpiruvato no se forma durante la reacciónde decarboxilación. Se debe descartar 1a posibilidad de que el ATP actúe enconcentraciones catalitica en 1a reacción. debido a su regeneracióncontinua a traves del sistema de la quinasa pirúvica, porquesi bien se determinó la presencia en los extractos utilizadosde esta última enzima, la misma requiere estrictamente lapresencia de Mg^++ ó Mn^++, en contraste con lo que ocurre con laactividad oxalacético decarboxilante de la enzima de levadura.que es inhibida por cationes divalentes (Mn^++; Zn^++; Cd+^+; Co^++y Mg^++). También los agentes complejantes de metales tienen accióninhibidora sobre la mencionada actividad decarboxilante. Así elverseno y la o-fenantrolina en concentraciones 6.7 x 10^-6 y 5 x 10-5 M ejercieron una inhibición cercana al 100%.La 8-hidroxiquinolinay el dietilditiocarbamato de amonio presentanuna acción inhibidora comparativamente menor. La acción inhibidoradel verseno puede ser suprimida por el agregado de unconcentración adecuada de iones Mn^++, pero en ese caso se observala acción inhibitoria propia del Mn^++. A1 igual que la reacción de fijación, la reacción de decarboxilaciónes inhibida por los reactivos de tioles, siendoel más efectivo el p-cloromercuribenzoato, siguiéndole en importanciael melarsen, N-etilmaleimida, iodosobenzoato y el iodoacetato. Se discute la posibilidad de que ambas actividades (fijaciónde anhídrido carbónico y decarboxilación del oxalacetato)correspondan a una misma enzima o bién estén relacionadascon entidades proteicas independientes. Además se describen una serie de experimentos realizadoscon P^32-fosfoenolpiruvato y C^14 02 que pueden interpretarse como unindicio de la formación de un complejo intermediario enzima-sustratosobre el que se llevaria a cabo la reacción decarboxilación. Finalmente se discuten los posibles mecanismos enzimáticosinvolucrados en la reacción, en relación a los resultadosobtenidos con la enzima de levadura de panaderia y otrasenzimas similares.
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Diálisis alcalina. para eliminar elsulfato de amonioy la cocarboxilasa. D) Eliminación de nucleatos por precipitación con sulfatode protamina. E) Fraccionamiento alcohólico en presencia de iones Ca^++recogiendo la fracción que cae entre 8.5 y 17% de concentraciónalcohólica (v/v). P) Precipitación con sulfato de amonio. Diálisis. G) Fraccionamiento alcohólico en presencia de iones Zn^++. H) Precipitación con sulfato de amonio. Diálisis. I) Cromatografía en columna de dietil amino etil celulosa (DEAE)(O alternativamente en columna de hidroxilapatita) J) Electroforesis de zona en columna de celulosa. La preparación final se comporta en los experimentos deelectroforesis libre y ultracentrifugación analítica como un sistemaaparentemente homogeneo. La enzima cataliza el intercambio de C^14 O2 con el carboxiloβ del oxalacetato a un pH óptimo cercano a 6.1 siendo lareacción dependiente de la presencia de ATP e iones Mn^++. En esascondiciones se pudo aislar oxalacetato radioactivo como 2-4 dinitrofenilhidrazona,la cual se identificó por cromatografía enpapel y radioautografía. La acción activadora que el ADP y elfosfoenolpiruvato ejercían sobre la reacción de intercambio sugirióque ambos compuestos podrian estar involucrados en lareacción de fijación, pero los primeros ensayos de carboxilacióndirecta del fosfoenolpiruvato realizados con extractos poco purificadosy en diversas condiciones experimentales fueron negativos. Ello recién fué posible llevando a cabo la reacción decarboxilación en presencia de la transaminasa aspártico-glutámicay glutamato o de la málico dehidrogenass y DPNH. En el primercaso utilizando C^14 O2 se pudo aislar y caracterizar por cromatografíaen papel y radioautografia, aspartato radioactivo yen el segundo caso se pudo seguir espectrofotometricamente elcurso de la reacción de oxidación del DPNH. La reacción de carboxilación del fosfoenolpiruvato requiere ADPe iones Mn^++ y tiene lugar a un pH óptimo de 5.4. El piruvatomas ATP no pueden reemplazar al fosfoenolpiruvato y ADP. La formación de ATP durante dicha reacción y la estequiometriade la mismase estudiaron utilizando un fosfoenolpiruvato marcadocon P^32 en el grupo fosfato y llevando a cabo la reacción enpresencia de C^14 O2. La determinación de las radioactividadescorrespondientes al ATP y oxalacetato formadas en esas condicionespermitió comprobar una estricta relación estequiométrica entreambas. La reacción es especifica para los polifosfatos de la adenosina,siendo la enzima inactiva con derivados de la guanosina,inosina, citidina y uridina ya sea en la fijación directa o enla de intercambio, en cambio los deoxiderivados de la adenosinaresultaron parcialmente activos. Si bien los extractos impuros presentan una parcial actividaden ausencia de cationes divalentes, los extractos altamentepurificados son sumamente dependientes de los mismos. El ion Mn^++ es el más activo de todos los cationes divalentes ensayados,siguiendole en importancia, el Zn^++, el Co^++, el Mg^++ y el Cd^++. Se estudió la influencia de la concentración de bicarbonatoen la reacción de carboxilación pudiéndose determinar la Km(C02) = 9.9 x 10^-3 M y la Km(CO3H^-) = 5 x 10^-3 M. Los reactivos de tioles ejercen acción inhibidora sobrela enzima. El p-cloromercuribenzoato fue el más efectivo puesen concentración 10^-4 M tuvouna acción inhibidora de casi el 100%.En esas condiciones la enzima puede ser reactivada parcialmentepor el glutation reducido, dependiendo el grado dereactivación de la duración del período previo de incubación dela enzima con el inhibidor. El melarsen fué menos efectivo (20%de inhibición con una concentración 0.66 x 10^-3 M). El iodosobenzoatoy la N-etilmaleimida en concentraciones 7 x 10^-4 y 5 x 10^-4 M respectivamente fueron inactivos. De los inhibidores de la asimilación de anhídrido carbónicopor la célula entera, que se ensayaron; 2-4 dinitrofenol,fluoruro y azida sódica, tan solo el último fue capaz de inhibiren forma significativa a la enzima. La enzima ejerce una marcada acción decarboxilante especificamentesobre el oxalacetato, siendo la reacción dependientede 1a presencia de concentraciones cataliticas de ATP, reemplazablepor ADP ó AMP y sus deoxi-derivados. Los otros nucleósidotrifosfatos ensayados carecen de acción activadora sobrela misma. Cuando la reacción se realiza en presencia de ATP, losproductos de la reacción son piruvato y fosfoenolpiruvato. Esteúltimo compuesto se identificó utilizando ATP marcado con P^32 en los grupos fosfatos ɣ y β y aislando un fosfoenolpiruvatoradicactivo. En los trabajos de rutina el fosfoenolpiruvatose determinó por el ortofosfato liberable por nitrato mercúrico. Con ADP ó AMP el fosfoenolpiruvato no se forma durante la reacciónde decarboxilación. Se debe descartar 1a posibilidad de que el ATP actúe enconcentraciones catalitica en 1a reacción. debido a su regeneracióncontinua a traves del sistema de la quinasa pirúvica, porquesi bien se determinó la presencia en los extractos utilizadosde esta última enzima, la misma requiere estrictamente lapresencia de Mg^++ ó Mn^++, en contraste con lo que ocurre con laactividad oxalacético decarboxilante de la enzima de levadura.que es inhibida por cationes divalentes (Mn^++; Zn^++; Cd+^+; Co^++y Mg^++). También los agentes complejantes de metales tienen accióninhibidora sobre la mencionada actividad decarboxilante. Así elverseno y la o-fenantrolina en concentraciones 6.7 x 10^-6 y 5 x 10-5 M ejercieron una inhibición cercana al 100%.La 8-hidroxiquinolinay el dietilditiocarbamato de amonio presentanuna acción inhibidora comparativamente menor. La acción inhibidoradel verseno puede ser suprimida por el agregado de unconcentración adecuada de iones Mn^++, pero en ese caso se observala acción inhibitoria propia del Mn^++. A1 igual que la reacción de fijación, la reacción de decarboxilaciónes inhibida por los reactivos de tioles, siendoel más efectivo el p-cloromercuribenzoato, siguiéndole en importanciael melarsen, N-etilmaleimida, iodosobenzoato y el iodoacetato. Se discute la posibilidad de que ambas actividades (fijaciónde anhídrido carbónico y decarboxilación del oxalacetato)correspondan a una misma enzima o bién estén relacionadascon entidades proteicas independientes. Además se describen una serie de experimentos realizadoscon P^32-fosfoenolpiruvato y C^14 02 que pueden interpretarse como unindicio de la formación de un complejo intermediario enzima-sustratosobre el que se llevaria a cabo la reacción decarboxilación. Finalmente se discuten los posibles mecanismos enzimáticosinvolucrados en la reacción, en relación a los resultadosobtenidos con la enzima de levadura de panaderia y otrasenzimas similares. Fil: Cannata, Joaquín J. B.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. 1962 Tesis Doctoral PDF Español info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n1123_Cannata

Carboxiquinasa fosfoenolpirúvica de levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae) : Aislamiento, purificación y propiedades

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