Cambios en el potencial de membrana en espermatozoides, aspectos moleculares y relevancia fisiológica en la fecundación de mamíferos
La capacitación (CAP) es un proceso fundamental que deben atravesar los espermatozoides para adquirir capacidad fecundante. Durante este proceso se activan vías de señalización que llevan a la exocitosis acrosomal (EA). Uno de los cambios moleculares tempranos de la CAP asociado a la EA es la hiperp...
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| Formato: | Tesis doctoral publishedVersion |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
2022
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| Materias: | |
| Acceso en línea: | https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7259_Balestrini |
| Aporte de: |
| Sumario: | La capacitación (CAP) es un proceso fundamental que deben atravesar los espermatozoides para adquirir capacidad fecundante. Durante este proceso se activan vías de señalización que llevan a la exocitosis acrosomal (EA). Uno de los cambios moleculares tempranos de la CAP asociado a la EA es la hiperpolarización del potencial de membrana (Em). Trabajos previos observaron que la hiperpolarización del Em es necesaria y suficiente para preparar a los espermatozoides murinos para realizar la EA en presencia de un inductor. Por otro lado, se observó que ratones Knock-out (KO) para el canal de potasio específico de espermatozoides SLO3, no hiperpolarizan el Em y son infértiles. Trabajos recientes en humanos, describieron una correlación entre el éxito en la fecundación in vitro (FIV) y la hiperpolarización del Em. En esta tesis, nos propusimos estudiar cuál es el mecanismo molecular que impide que un espermatozoide no capacitado (NC) realice la EA; y cuál es el rol del Em durante la CAP en condiciones in vivo. Utilizamos espermatozoides humanos NC hiperpolarizados farmacológicamente con Valinomicina (Val) o Amiloride. La inducción de la EA se realizó con compuestos fisiológicos como progesterona (Prog) y Cloruro de potasio (KCl) y farmacológicos como el ionóforo de calcio A23187. Mediante la técnica Pisum sativum, encontramos que los espermatozoides NC hiperpolarizados farmacológicamente son capaces de realizar la EA y al bloquear la hiperpolarización del Em en espermatozoides CAP se inhibe la EA. Indicando que la hiperpolarización del Em es necesaria y suficiente para que espermatozoides humanos realicen la EA. Mediante ensayos de célula única, se monitoreó en simultáneo el estado acrosomal y los movimientos de Ca2+ intracelular ([Ca2+]i), dado su participación reportada para iniciar los procesos de exocitosis. Se observó que el mecanismo que impide que los espermatozoides NC realicen la EA es que presentan un patrón de [Ca2+]i de tipo oscilatorio. La hiperpolarización farmacológica modula la respuesta de [Ca2+]i, disminuyendo el número de células con un patrón oscilatorio, permitiendo que los espermatozoides estén listos para realizar la EA. Por lo tanto, proponemos que la modulación de las oscilaciones de [Ca2+]i, a través de la hiperpolarización del Em asociada a la CAP es el principal mecanismo para transformar una célula que no responde a los estímulos en una que sí lo hace. Luego, para evaluar el rol fisiológico de la hiperpolarización del Em in vivo, utilizamos un nuevo modelo de ratón transgénico: RGM-SLO3 (Ratón rojo y verde: RGM) ratones macho KO para el canal SLO3, que previamente fueron cruzados con una línea transgénica que posee espermatozoides con marca EGFP (verde) en el acrosoma y DsRed2 (rojo) en las mitocondrias. El RGM- SLO3, nos permite monitorear el estado acrosomal de los espermatozoides y su migración a lo largo del tracto reproductor femenino realizando apareos entre lo machos KO o wild-type (WT) con hembras WT. Se corroboró que en los espermatozoides de machos KO no se induce la EA cuando se los trata con A23187, ni tampoco cuando se los trata con Prog. La pre-incubación con Val permitió que los espermatozoides de machos KO induzcan la EA en presencia de Prog y A23187. Al realizar los apareos encontramos que aunque la cantidad de espermatozoides presentes en el epidídimo y el número de espermatozoides que ingresa a la unión útero-tubárica es similar entre ratones KO y WT, el número de espermatozoides que ingresan al isthmus oviductal es menor cuando el macho es KO. Sorprendentemente, se encontraron espermatozoides provenientes de machos KO en la ampulla, el sitio de fecundación pero estos mayoritariamente poseen acrosoma intacto a diferencia del WT donde todos lo espermatozoides observados se encuentran reaccionados. Finalmente, estudiamos si los espermatozoides que llegan reaccionados a la ampulla son capaces de fecundar a los oocitos. Se observó la presencia de embriones de dos células en el KO pero al evaluar el estadio de blastocisto y de 2 pronúcleos no observamos desarrollo. En base a estos resultados, concluimos que: 1) el potencial de membrana espermático contribuye a la selección de los espermatozoides que ingresan y colonizan el oviducto y es esencial para la EAin vivo; 2) la EA no es necesaria para que los espermatozoides migren hacia el sitio de fecundación; 3) espermatozoides de los ratones RGM-SLO3 KO que llegan a la ampulla no son capaces de fecundar, sugiriendo que la hiperpolarización del Em es necesaria para eventos que ocurren luego de la penetración de la zona pelúcida. |
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