Cambios en el potencial de membrana en espermatozoides, aspectos moleculares y relevancia fisiológica en la fecundación de mamíferos

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La capacitación (CAP) es un proceso fundamental que deben atravesar los espermatozoides para adquirir capacidad fecundante. Durante este proceso se activan vías de señalización que llevan a la exocitosis acrosomal (EA). Uno de los cambios moleculares tempranos de la CAP asociado a la EA es la hiperp...

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Autor principal: Balestrini, Paula Ania
Otros Autores: Buffone, Mariano Gabriel
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2022
Materias:
POTENCIAL DE MEMBRANA
EXOCITOSIS ACROSOMAL
CAPACITACION
OVIDUCTO
MEMBRANE POTENTIAL
ACROSOMAL EXOCYTOSIS
CAPACITATION
OVIDUCT
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7259_Balestrini
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description La capacitación (CAP) es un proceso fundamental que deben atravesar los espermatozoides para adquirir capacidad fecundante. Durante este proceso se activan vías de señalización que llevan a la exocitosis acrosomal (EA). Uno de los cambios moleculares tempranos de la CAP asociado a la EA es la hiperpolarización del potencial de membrana (Em). Trabajos previos observaron que la hiperpolarización del Em es necesaria y suficiente para preparar a los espermatozoides murinos para realizar la EA en presencia de un inductor. Por otro lado, se observó que ratones Knock-out (KO) para el canal de potasio específico de espermatozoides SLO3, no hiperpolarizan el Em y son infértiles. Trabajos recientes en humanos, describieron una correlación entre el éxito en la fecundación in vitro (FIV) y la hiperpolarización del Em. En esta tesis, nos propusimos estudiar cuál es el mecanismo molecular que impide que un espermatozoide no capacitado (NC) realice la EA; y cuál es el rol del Em durante la CAP en condiciones in vivo. Utilizamos espermatozoides humanos NC hiperpolarizados farmacológicamente con Valinomicina (Val) o Amiloride. La inducción de la EA se realizó con compuestos fisiológicos como progesterona (Prog) y Cloruro de potasio (KCl) y farmacológicos como el ionóforo de calcio A23187. Mediante la técnica Pisum sativum, encontramos que los espermatozoides NC hiperpolarizados farmacológicamente son capaces de realizar la EA y al bloquear la hiperpolarización del Em en espermatozoides CAP se inhibe la EA. Indicando que la hiperpolarización del Em es necesaria y suficiente para que espermatozoides humanos realicen la EA. Mediante ensayos de célula única, se monitoreó en simultáneo el estado acrosomal y los movimientos de Ca2+ intracelular ([Ca2+]i), dado su participación reportada para iniciar los procesos de exocitosis. Se observó que el mecanismo que impide que los espermatozoides NC realicen la EA es que presentan un patrón de [Ca2+]i de tipo oscilatorio. La hiperpolarización farmacológica modula la respuesta de [Ca2+]i, disminuyendo el número de células con un patrón oscilatorio, permitiendo que los espermatozoides estén listos para realizar la EA. Por lo tanto, proponemos que la modulación de las oscilaciones de [Ca2+]i, a través de la hiperpolarización del Em asociada a la CAP es el principal mecanismo para transformar una célula que no responde a los estímulos en una que sí lo hace. Luego, para evaluar el rol fisiológico de la hiperpolarización del Em in vivo, utilizamos un nuevo modelo de ratón transgénico: RGM-SLO3 (Ratón rojo y verde: RGM) ratones macho KO para el canal SLO3, que previamente fueron cruzados con una línea transgénica que posee espermatozoides con marca EGFP (verde) en el acrosoma y DsRed2 (rojo) en las mitocondrias. El RGM- SLO3, nos permite monitorear el estado acrosomal de los espermatozoides y su migración a lo largo del tracto reproductor femenino realizando apareos entre lo machos KO o wild-type (WT) con hembras WT. Se corroboró que en los espermatozoides de machos KO no se induce la EA cuando se los trata con A23187, ni tampoco cuando se los trata con Prog. La pre-incubación con Val permitió que los espermatozoides de machos KO induzcan la EA en presencia de Prog y A23187. Al realizar los apareos encontramos que aunque la cantidad de espermatozoides presentes en el epidídimo y el número de espermatozoides que ingresa a la unión útero-tubárica es similar entre ratones KO y WT, el número de espermatozoides que ingresan al isthmus oviductal es menor cuando el macho es KO. Sorprendentemente, se encontraron espermatozoides provenientes de machos KO en la ampulla, el sitio de fecundación pero estos mayoritariamente poseen acrosoma intacto a diferencia del WT donde todos lo espermatozoides observados se encuentran reaccionados. Finalmente, estudiamos si los espermatozoides que llegan reaccionados a la ampulla son capaces de fecundar a los oocitos. Se observó la presencia de embriones de dos células en el KO pero al evaluar el estadio de blastocisto y de 2 pronúcleos no observamos desarrollo. En base a estos resultados, concluimos que: 1) el potencial de membrana espermático contribuye a la selección de los espermatozoides que ingresan y colonizan el oviducto y es esencial para la EAin vivo; 2) la EA no es necesaria para que los espermatozoides migren hacia el sitio de fecundación; 3) espermatozoides de los ratones RGM-SLO3 KO que llegan a la ampulla no son capaces de fecundar, sugiriendo que la hiperpolarización del Em es necesaria para eventos que ocurren luego de la penetración de la zona pelúcida.
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spelling tesis:tesis_n7259_Balestrini2025-09-10T16:04:59Z Cambios en el potencial de membrana en espermatozoides, aspectos moleculares y relevancia fisiológica en la fecundación de mamíferos Membrane potential changes in sperm cells, molecular and physiological relevance in mammalian fertilization Balestrini, Paula Ania Buffone, Mariano Gabriel Krapf, Darío POTENCIAL DE MEMBRANA EXOCITOSIS ACROSOMAL CAPACITACION OVIDUCTO MEMBRANE POTENTIAL ACROSOMAL EXOCYTOSIS CAPACITATION OVIDUCT La capacitación (CAP) es un proceso fundamental que deben atravesar los espermatozoides para adquirir capacidad fecundante. Durante este proceso se activan vías de señalización que llevan a la exocitosis acrosomal (EA). Uno de los cambios moleculares tempranos de la CAP asociado a la EA es la hiperpolarización del potencial de membrana (Em). Trabajos previos observaron que la hiperpolarización del Em es necesaria y suficiente para preparar a los espermatozoides murinos para realizar la EA en presencia de un inductor. Por otro lado, se observó que ratones Knock-out (KO) para el canal de potasio específico de espermatozoides SLO3, no hiperpolarizan el Em y son infértiles. Trabajos recientes en humanos, describieron una correlación entre el éxito en la fecundación in vitro (FIV) y la hiperpolarización del Em. En esta tesis, nos propusimos estudiar cuál es el mecanismo molecular que impide que un espermatozoide no capacitado (NC) realice la EA; y cuál es el rol del Em durante la CAP en condiciones in vivo. Utilizamos espermatozoides humanos NC hiperpolarizados farmacológicamente con Valinomicina (Val) o Amiloride. La inducción de la EA se realizó con compuestos fisiológicos como progesterona (Prog) y Cloruro de potasio (KCl) y farmacológicos como el ionóforo de calcio A23187. Mediante la técnica Pisum sativum, encontramos que los espermatozoides NC hiperpolarizados farmacológicamente son capaces de realizar la EA y al bloquear la hiperpolarización del Em en espermatozoides CAP se inhibe la EA. Indicando que la hiperpolarización del Em es necesaria y suficiente para que espermatozoides humanos realicen la EA. Mediante ensayos de célula única, se monitoreó en simultáneo el estado acrosomal y los movimientos de Ca2+ intracelular ([Ca2+]i), dado su participación reportada para iniciar los procesos de exocitosis. Se observó que el mecanismo que impide que los espermatozoides NC realicen la EA es que presentan un patrón de [Ca2+]i de tipo oscilatorio. La hiperpolarización farmacológica modula la respuesta de [Ca2+]i, disminuyendo el número de células con un patrón oscilatorio, permitiendo que los espermatozoides estén listos para realizar la EA. Por lo tanto, proponemos que la modulación de las oscilaciones de [Ca2+]i, a través de la hiperpolarización del Em asociada a la CAP es el principal mecanismo para transformar una célula que no responde a los estímulos en una que sí lo hace. Luego, para evaluar el rol fisiológico de la hiperpolarización del Em in vivo, utilizamos un nuevo modelo de ratón transgénico: RGM-SLO3 (Ratón rojo y verde: RGM) ratones macho KO para el canal SLO3, que previamente fueron cruzados con una línea transgénica que posee espermatozoides con marca EGFP (verde) en el acrosoma y DsRed2 (rojo) en las mitocondrias. El RGM- SLO3, nos permite monitorear el estado acrosomal de los espermatozoides y su migración a lo largo del tracto reproductor femenino realizando apareos entre lo machos KO o wild-type (WT) con hembras WT. Se corroboró que en los espermatozoides de machos KO no se induce la EA cuando se los trata con A23187, ni tampoco cuando se los trata con Prog. La pre-incubación con Val permitió que los espermatozoides de machos KO induzcan la EA en presencia de Prog y A23187. Al realizar los apareos encontramos que aunque la cantidad de espermatozoides presentes en el epidídimo y el número de espermatozoides que ingresa a la unión útero-tubárica es similar entre ratones KO y WT, el número de espermatozoides que ingresan al isthmus oviductal es menor cuando el macho es KO. Sorprendentemente, se encontraron espermatozoides provenientes de machos KO en la ampulla, el sitio de fecundación pero estos mayoritariamente poseen acrosoma intacto a diferencia del WT donde todos lo espermatozoides observados se encuentran reaccionados. Finalmente, estudiamos si los espermatozoides que llegan reaccionados a la ampulla son capaces de fecundar a los oocitos. Se observó la presencia de embriones de dos células en el KO pero al evaluar el estadio de blastocisto y de 2 pronúcleos no observamos desarrollo. En base a estos resultados, concluimos que: 1) el potencial de membrana espermático contribuye a la selección de los espermatozoides que ingresan y colonizan el oviducto y es esencial para la EAin vivo; 2) la EA no es necesaria para que los espermatozoides migren hacia el sitio de fecundación; 3) espermatozoides de los ratones RGM-SLO3 KO que llegan a la ampulla no son capaces de fecundar, sugiriendo que la hiperpolarización del Em es necesaria para eventos que ocurren luego de la penetración de la zona pelúcida. Membrane potential changes in sperm cells, molecular and physiological relevance in mammalian fertilization. Capacitation (CAP) is a fundamental process that spermatozoa must undergo to acquire fertilizing capacity. During this process, several signaling pathways are induced that lead to acrosomal exocytosis (AE). One of the early molecular events associated with CAP is hyperpolarization of the membrane potential (Em). Previous work on murine spermatozoa found that Em hyperpolarization is necessary y sufficient to prepare non-capacitated (NC) sperm to perform EA in the presence of an inducer. On the other hand, it was observed that Knock-out (KO) mice for the sperm-specific potassium channel SLO3 do not hyperpolarize the Em y are infertile. Lastly, more recent work in humans described a correlation between success in in vitro fertilization (IVF) y Em hyperpolarization. In this thesis, we set out to study the molecular mechanism that prevents NC sperm from performing AE; y what is the role of the Em during CAP. We induced hyperpolarization pharmacologically, in NC human sperm, with Valinomycin (Val) or Amiloride. AE induction was carried out with physiological compounds such as progesterone (Prog) y KCl y with the pharmacological compound A23187. Then, the acrosomal status was evaluated using the Pisum sativum technique. We found that pharmacologically hyperpolarized NC sperm are able to undergo AE y that blocking Em hyperpolarization in CAP sperm inhibits AE. These results indicate that Em hyperpolarization is necessary y sufficient for human spermatozoa to perform AE. On the other hand, given the participation of intracellular Ca2+ ([Ca2+]i) in initiating exocytic processes, single cell assays to simultaneously monitor the acrosomal status y [Ca2+]i movements were performed. We found that the mechanism that prevents NC spermatozoa from carrying out AE is that they present an oscillatory-type of [Ca2+]i pattern. Pharmacological hyperpolarization modulates the [Ca2+]i response, decreasing the number of cells with an oscillatory pattern of [Ca2+]i, allowing spermatozoa to be ready to induce AE when treated with Prog or KCl. Therefore, we propose that the modulation of [Ca2+]i oscillations, through capacitation-associated membrane hyperpolarization, is the main mechanism that promotes a cell switch from a non- responsive sperm cell into one that responses to stimuli. To evaluate the physiological role of Em hyperpolarization y to assess the relevance of AE during sperm migration in the female reproductive tract, we generated a new transgenic mouse model by mating female SLO3 KO mice, with male transgenic mice expressing EGFP in their acrosome y DsRed2 in the mitochondria. This new transgenic mouse, RGM-SLO3 (Red y Green Mouse: RGM), allowed us to observe the acrosomal status while sperm migrate through the female reproductive tract by performing mattings between RGM-SLO3 KO or RGM-SLO3 Wild-Type (WT) males y WT female mice. First, we found that RGM-SLO3 KO males mated less than the RGM-SLO3 WT. More interestingly, although the concentration of sperm in the epididymis y utero-tubal junction was similar between RGM-SLO3 WT y RGM-SLO3 KO males, the number of sperm reaching the oviduct isthmus was lower when the male was RGM-SLO3 KO. Surprisingly, both RGM-SLO3 WT y RGM-SLO3 KO sperm reached the ampulla, the site of fertilization. However, unlike the RGM-SLO3 WT sperm, most RGM-SLO3 KO sperm were acrosome-intact. Next, we evaluated if acrosome-reacted sperm that have reached the ampulla were able to fertilize the oocytes. Although we found, for the KO, a small percentage of two-cell stage embryos, we did not observe blastocyst nor 2 pronuclear stages. Based on these results we conclude that: 1) sperm Em hyperpolarization contributes to the selection of sperm that enter y colonize the oviduct y is essential for AE in vivo; 2) the AE is not necessary for sperm migration to the ampulla; y 3) acrosome-reacted sperm from the RGM-SLO3 KO mice that reached the ampulla are not able to fertilize suggesting that Em hyperpolarization is necessary for events occurring after penetration of the zona pellucida. Fil: Balestrini, Paula Ania. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2022-12-22 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7259_Balestrini

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