Participación de la calicreína tisular (KLK1) en la función hipofisaria y el desarrollo de prolactinomas

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Los prolactinomas son los adenomas hipofisarios más frecuentes y se caracterizan por una hiperplasia e hipertrofia de lactrotropos, acompañada de una marcada hiperprolactinemia. Entre un 15-20% de pacientes no responden a la terapia actual con agonistas dopaminérgicos y son considerados prolactinoma...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Abeledo Machado, Alejandra Inés
Otros Autores:	Díaz-Torga, Graciela
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2022
Materias:	HIPOFISIS PROLACTINOMA B1R B2R KLK1 TGFβ1 PITUITARY
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7117_AbeledoMachado
Aporte de:	Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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description	Los prolactinomas son los adenomas hipofisarios más frecuentes y se caracterizan por una hiperplasia e hipertrofia de lactrotropos, acompañada de una marcada hiperprolactinemia. Entre un 15-20% de pacientes no responden a la terapia actual con agonistas dopaminérgicos y son considerados prolactinomas resistentes (DARPs, por sus siglas en inglés). El tratamiento de este tipo de tumores sigue representando un desafío para los endocrinólogos ya que actualmente no existen terapias farmacológicas alternativas a los agonistas dopaminérgicos. En nuestro laboratorio estudiamos diferentes sistemas inhibitorios intrahipofisarios en búsqueda de nuevos blancos terapéuticos. Se ha descripto que calicreína tisular (KLK1) activa TGFβ1, un potente inhibidor de la síntesis y secreción de PRL, en determinados tejidos. Dicha proteasa es conocida por clivar al quininógeno produciendo quininas, los péptidos bioactivos del sistema, que actúan sobre receptores específicos de 7 pasos transmembrana; B1R y B2R. Recientemente se encontró que el B2R se encuentra sobreexpresado (unas 20 veces) en prolactinomas humanos respecto a hipófisis normales. Se ha descripto que B2R y el receptor de dopamina tipo 2 (D2R) pueden formar un heterodímero funcional y que la activación de B2R en el heterodímero anula la cascada de señalización de D2R. Si bien el sistema calicreína-quininas (KKS) es muy conocido por su función en el sistema vascular, su función en hipófisis es desconocida. El objetivo principal de este trabajo es caracterizar al sistema KKS hipofisario y su participación en el control de la función normal y patológica (prolactinoma) del lactotropo. El estudio se llevó a cabo en dos modelos animales de prolactinoma: 1) ratones deficientes del receptor dopaminérgico D2 (Drd2-/-); y; 2) ratones que sonbreexpresan la subunidad β de gonadotrofina coriónica humana (hCGβ). Demostramos que: 1- Los diversos componentes del KKS se expresan localmente en la hipófisis (quininasas I y II, receptores de bradiquinina, B1R y B2R) y su expresión se altera con el desarrollo de un prolactinoma. 2- Existe una marcada diferencia sexual en la expresión de dichos componentes (mayor en machos respecto de las hembras). 3- Los principales factores regulatorios del lactotropo (DA y estradiol) también regulan la expresión génica de los componentes de KKS: DA regula positivamente la expresión de KLK1 y BRs, principalmente en hembras, mientras que estradiol inhibe la expresión génica de KLK1 y B2R en ambos sexos. 4- KLK1 induce la liberación de PRL en ambos sexos. 5- La activación de B1R y B2R con agonistas específicos induce una liberación de PRL en los machos, pero una inhibición de la secreción de PRL en las hembras de forma dosis-dependiente. 6- La formación del heterodímero D2R/B2R por la metodología de NanoBiT® en HEK 293T transfectadas transcientemente (con ambos receptores) y validamos la funcionalidad de B2R mediante el reclutamiento de proteínas Gα (principalmente Gq y en menor medida Gi). 7- En células co-transfectadas con B2R y D2R humano, la activación del B2R promueve la movilización de calcio intracelular y su respuesta no se ve alterada en el heterómero B2R/D2R. 8- Finalmente, mediante la técnica AlphaLiSA validamos la interacción de B2R y D2R en prolactinomas humanos y en adenomas no funcionantes humanos. En el presente trabajo caracterizamos por primera vez al sistema KLK1-quininas hipofisario, encontramos importantes diferencias sexuales en su expresión y alteraciones del sistema con la formación de prolactinomas. Validamos la interacción de B2R/D2R en prolactinomas humanos y encontramos que también interactúan en adenomas hipofisarios no funcionantes. Estos resultados en su conjunto demuestran un rol importante del sistema KLK1-quininas en el control de la secreción de PRL, posicionando al sistema como un modulador intra-hipofisario sexualmente dimórfico con una potencial participación en el desarrollo de prolactinomas.
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En nuestro laboratorio estudiamos diferentes sistemas inhibitorios intrahipofisarios en búsqueda de nuevos blancos terapéuticos. Se ha descripto que calicreína tisular (KLK1) activa TGFβ1, un potente inhibidor de la síntesis y secreción de PRL, en determinados tejidos. Dicha proteasa es conocida por clivar al quininógeno produciendo quininas, los péptidos bioactivos del sistema, que actúan sobre receptores específicos de 7 pasos transmembrana; B1R y B2R. Recientemente se encontró que el B2R se encuentra sobreexpresado (unas 20 veces) en prolactinomas humanos respecto a hipófisis normales. Se ha descripto que B2R y el receptor de dopamina tipo 2 (D2R) pueden formar un heterodímero funcional y que la activación de B2R en el heterodímero anula la cascada de señalización de D2R. Si bien el sistema calicreína-quininas (KKS) es muy conocido por su función en el sistema vascular, su función en hipófisis es desconocida. El objetivo principal de este trabajo es caracterizar al sistema KKS hipofisario y su participación en el control de la función normal y patológica (prolactinoma) del lactotropo. El estudio se llevó a cabo en dos modelos animales de prolactinoma: 1) ratones deficientes del receptor dopaminérgico D2 (Drd2-/-); y; 2) ratones que sonbreexpresan la subunidad β de gonadotrofina coriónica humana (hCGβ). Demostramos que: 1- Los diversos componentes del KKS se expresan localmente en la hipófisis (quininasas I y II, receptores de bradiquinina, B1R y B2R) y su expresión se altera con el desarrollo de un prolactinoma. 2- Existe una marcada diferencia sexual en la expresión de dichos componentes (mayor en machos respecto de las hembras). 3- Los principales factores regulatorios del lactotropo (DA y estradiol) también regulan la expresión génica de los componentes de KKS: DA regula positivamente la expresión de KLK1 y BRs, principalmente en hembras, mientras que estradiol inhibe la expresión génica de KLK1 y B2R en ambos sexos. 4- KLK1 induce la liberación de PRL en ambos sexos. 5- La activación de B1R y B2R con agonistas específicos induce una liberación de PRL en los machos, pero una inhibición de la secreción de PRL en las hembras de forma dosis-dependiente. 6- La formación del heterodímero D2R/B2R por la metodología de NanoBiT® en HEK 293T transfectadas transcientemente (con ambos receptores) y validamos la funcionalidad de B2R mediante el reclutamiento de proteínas Gα (principalmente Gq y en menor medida Gi). 7- En células co-transfectadas con B2R y D2R humano, la activación del B2R promueve la movilización de calcio intracelular y su respuesta no se ve alterada en el heterómero B2R/D2R. 8- Finalmente, mediante la técnica AlphaLiSA validamos la interacción de B2R y D2R en prolactinomas humanos y en adenomas no funcionantes humanos. En el presente trabajo caracterizamos por primera vez al sistema KLK1-quininas hipofisario, encontramos importantes diferencias sexuales en su expresión y alteraciones del sistema con la formación de prolactinomas. Validamos la interacción de B2R/D2R en prolactinomas humanos y encontramos que también interactúan en adenomas hipofisarios no funcionantes. Estos resultados en su conjunto demuestran un rol importante del sistema KLK1-quininas en el control de la secreción de PRL, posicionando al sistema como un modulador intra-hipofisario sexualmente dimórfico con una potencial participación en el desarrollo de prolactinomas. Prolactinomas are prolactin-secreting adenomas that can be effectively treated with dopamine D2 receptors (D2R) agonists. Nevertheless, a subset of prolactinomas (between 15 and 20%, known as dopamine agonist-resistant prolactinomas: DARPs) do not respond to the treatment. These tumors represent a major challenge for clinical management due to alternative therapies are not yet available. The long-term objective of our laboratory is to develop new treatments for patients with DARPs. We principally study the intra-pituitary inhibitory systems on lactotroph function. It has been described that tissue kallikrein (KLK1) activates latent TGFβ1, a potent inhibitor of lactotroph cell proliferation and prolactin (PRL) secretion, in specific tissues. The main function of KLK1 is the proteolytic cleavage of kininogen to release kinins: Bradykinin and Kallidin, which exert their effect through their receptors B1R and B2R. Recently, B2R protein expression was found to be strongly increased (~20-fold increase) in human prolactinomas compared to normal pituitaries. Moreover, in HEK293 cell line it was demonstrated that D2R can heteromerize with B2R. The specific B2R-stimulation abolishes the downstream signal of D2R. Although the kallikrein-quinin system (KKS) has been associated with cardiovascular regulation, very little is known about the function of KKS in the pituitary gland and its involvement in prolactinoma development. The main goals of this thesis are to characterize the pituitary KKS and to elucidate its participation, if any, in the control of lactotroph function in normal and tumoral pituitaries. This study was carried out in two animal models of prolactinoma: 1) mice lacking functional D2R (Drd2-/-); and 2) mice overexpressing the β-subunit of human chorionic gonadotrophin hormone (hCGβ). We demonstrated that: 1- The components of KKS are expressed in the pituitary (kininases I and II, BRs, KLK1) and its expression is altered in prolactinomas. 2- There are important gender differences in the expression of KKS components, being higher in male pituitaries than in females. 3- Dopamine and estradiol, the main factors controlling lactotroph function, regulate the expression of KKS components. DA has a positive regulation of KLK1 and BRs gene expression, principally in female pituitaries. While estradiol inhibits KLK1 and B2R expression in both genders. 4- KLK1 induces PRL secretion in both males and females. 5- The specific activation of B1R or B2R with selective agonists, induces PRL secretion in males. On the contrary, it exerts a dose-dependent inhibition of PRL secretion in females. 6- We also demonstrated the D2R/B2R complex formation in HEK 293T transiently transfected (with both human receptors) by using a NanoBiT ® protein- protein interaction assay, and we validated the functionality of B2R by Gα recruitment (mainly Gq and to a lesser extent Gi). 7- In HEK 293T transiently transfected with human B2R and D2R, the B2R activation induced intracellular calcium mobilization. This response was not altered in B2R/D2R complexes. 8- Finally, we demonstrated, using the AlphaLiSA assay, the B2R/D2R interaction in human prolactinomas and in non-functioning human pituitary adenomas. Summarizing, we characterized, for the first time, the KLK1-kinins system in the pituitary gland, describing important gender differences in the expression of its components and in the impact on PRL secretion. We also described alterations of KKS in experimental prolactinomas. We validated B2R/D2R interaction in human prolactinomas and human non-functioning pituitary adenomas. These results show a gender-specific function of KKS in the control of PRL secretion and suggest a potential role of this system in prolactinoma development. Fil: Abeledo Machado, Alejandra Inés. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2022-07-18 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7117_AbeledoMachado

Participación de la calicreína tisular (KLK1) en la función hipofisaria y el desarrollo de prolactinomas

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