Análisis proteómico y bioinformático de los interactores de HO-1 en cáncer de próstata : identificación de MX1 y su asociación al estrés de retículo.

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El cáncer de próstata (PCa) es la segunda causa de muerte por cáncer en hombres en todo el mundo. El PCa localizado puede curarse en la mayoría de los casos, pero cuando la enfermedad escapa los confines de la glándula, las posibilidades de cura disminuyen drásticamente. La ablación de andrógenos es...

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Autor principal: Ortiz, Emiliano Germán
Otros Autores: Gueron, Geraldine
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2020
Materias:
HEMO-OXIGENASA 1
PROTEINA DE RESISTENCIA A MYXOVIRUS
ESTRES DE RETICULO ENDOPLASMICO
RESPUESTA A PROTEINAS MAL PLEGADAS
CANCER DE PROSTATA
HEME-OXIGENASE 1
MYXOVIRUS RESISTANCE PROTEIN
ENDOPLASMIC RETICULUM STRESS
UNFOLDED PROTEIN RESPONSE
PROSTATE CANCER
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6946_Ortiz
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description El cáncer de próstata (PCa) es la segunda causa de muerte por cáncer en hombres en todo el mundo. El PCa localizado puede curarse en la mayoría de los casos, pero cuando la enfermedad escapa los confines de la glándula, las posibilidades de cura disminuyen drásticamente. La ablación de andrógenos es la forma más efectiva de detener la progresión del PCa; pero con el tiempo, el crecimiento del cáncer se reanuda en la mayoría de los casos, y la enfermedad se vuelve "resistente a la castración". El microambiente tumoral inflamatorio es un nicho fértil que libera especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que acelera la transformación maligna. La hemo-oxigenasa 1 (HO-1), enzima limitante en la degradación del grupo hemo, representa un evento esencial en las respuestas celulares a las agresiones pro-oxidativas y pro-inflamatorias. Previamente trabajos de nuestro laboratorio documentaron que HO-1 tiene un fuerte efecto antitumoral in vivo e in vitro. En esta tesis, llevamos a cabo un estudio proteómico y bioinformático utilizando la técnica LC ESI-MS/MS para construir el interactoma de HO-1 en PCa, en un esfuerzo por identificar interactores moleculares de HO-1, que pudieran explicar las funciones biológicas de esta proteína en esta enfermedad, más allá de su rol canónico. Utilizando bases de datos públicas de perfiles de expresión de pacientes con PCa, se evaluó la importancia clínica de los interactores de HO-1. Las proteínas se agruparon en tres grupos de acuerdo con su perfil de expresión. En paralelo, llevamos a cabo un análisis de RNA-Seq para comparar los perfiles de expresión génica entre células de PCa con inducción farmacológica o genética de la expresión de HO-1 y sus respectivos controles, para evaluar la capacidad de HO-1 de regular la expresión a nivel transcripcional de las proteínas incluidas en estos grupos. Teniendo en cuenta toda la información obtenida de los diferentes análisis realizados, este trabajo de tesis se centró en el gen MX1 (proteína de resistencia al mixovirus), ya que los resultados mostraron que: 1) presentaba sobre-expresión significativa bajo inducción de HO-1; 2) el gen se encontraba significativamente sub-expresado en PCa versus próstata normal y 3) su pérdida se asoció con una disminución del tiempo de sobrevida libre de recaída de la enfermedad (P≤ 0.05). Cabe destacar que hubo una correlación positiva significativa entre la expresión de MX1 y HO-1 en pacientes con PCa. Además, se evaluaron las implicancias de la modulación de HO-1 sobre MX1 en células de PCa. Los análisis por RT-qPCR e inmunofluorescencia mostraron un aumento significativo de la expresión de MX1 bajo la inducción de HO-1. Considerando que HO-1 es inducible por condiciones inflamatorias y de estrés y que está anclada en el retículo endoplásmico (ER), analizamos los niveles de expresión de MX1 y HO-1 en respuesta al estrés de ER (ERS), utilizando tapsigargina. Los resultados mostraron un aumento significativo de los niveles de ARNm para ambos genes bajo ERS. La confirmación de ERS se comprobó mediante la inducción de los marcadores de este proceso: HSPA5, DDIT3 y XBP1. Por el contrario, el silenciamiento de MX1 revirtió estas alteraciones. Además, evaluamos el efecto de ERS sobre la apoptosis y la autofagia. Los resultados mostraron que, bajo ERS, la apoptosis y la autofagia aumentaron significativamente. Luego, un segundo análisis bioinformático demostró que el aumento en la expresión de MX1, reduce el riesgo de recaída bioquímica en pacientes con PCa sometida a prostatectomía radical. Al realizar un modelo multivariable en el que se incluyen MX1, HMOX1 y los genes que participan en la vía de ERS (HSPA5, DDIT3, XBP1, ATF4, ATF6, EIF2AK3 y ERN1), ningún gen por si solo pudo explicar la recaída bioquímica, lo que lleva a inferir una correlación estrecha entre estos genes; así, los genes ERS podrían responder a las alteraciones génicas de MX1, que, a su vez, puede ser modulado por HO-1. En resumen, los resultados de este trabajo de tesis identifican a MX1 como un interactor novel de HO-1 y un blanco modulado por HO-1, asociado con procesos ERS en el PCa. MX1 podría inclinar el equilibrio de ERS hacia eventos pro-muerte en la patología prostática maligna, lo que lo convierte en un blanco prometedor para el desarrollo de nuevas terapias.
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El microambiente tumoral inflamatorio es un nicho fértil que libera especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que acelera la transformación maligna. La hemo-oxigenasa 1 (HO-1), enzima limitante en la degradación del grupo hemo, representa un evento esencial en las respuestas celulares a las agresiones pro-oxidativas y pro-inflamatorias. Previamente trabajos de nuestro laboratorio documentaron que HO-1 tiene un fuerte efecto antitumoral in vivo e in vitro. En esta tesis, llevamos a cabo un estudio proteómico y bioinformático utilizando la técnica LC ESI-MS/MS para construir el interactoma de HO-1 en PCa, en un esfuerzo por identificar interactores moleculares de HO-1, que pudieran explicar las funciones biológicas de esta proteína en esta enfermedad, más allá de su rol canónico. Utilizando bases de datos públicas de perfiles de expresión de pacientes con PCa, se evaluó la importancia clínica de los interactores de HO-1. Las proteínas se agruparon en tres grupos de acuerdo con su perfil de expresión. En paralelo, llevamos a cabo un análisis de RNA-Seq para comparar los perfiles de expresión génica entre células de PCa con inducción farmacológica o genética de la expresión de HO-1 y sus respectivos controles, para evaluar la capacidad de HO-1 de regular la expresión a nivel transcripcional de las proteínas incluidas en estos grupos. Teniendo en cuenta toda la información obtenida de los diferentes análisis realizados, este trabajo de tesis se centró en el gen MX1 (proteína de resistencia al mixovirus), ya que los resultados mostraron que: 1) presentaba sobre-expresión significativa bajo inducción de HO-1; 2) el gen se encontraba significativamente sub-expresado en PCa versus próstata normal y 3) su pérdida se asoció con una disminución del tiempo de sobrevida libre de recaída de la enfermedad (P≤ 0.05). Cabe destacar que hubo una correlación positiva significativa entre la expresión de MX1 y HO-1 en pacientes con PCa. Además, se evaluaron las implicancias de la modulación de HO-1 sobre MX1 en células de PCa. Los análisis por RT-qPCR e inmunofluorescencia mostraron un aumento significativo de la expresión de MX1 bajo la inducción de HO-1. Considerando que HO-1 es inducible por condiciones inflamatorias y de estrés y que está anclada en el retículo endoplásmico (ER), analizamos los niveles de expresión de MX1 y HO-1 en respuesta al estrés de ER (ERS), utilizando tapsigargina. Los resultados mostraron un aumento significativo de los niveles de ARNm para ambos genes bajo ERS. La confirmación de ERS se comprobó mediante la inducción de los marcadores de este proceso: HSPA5, DDIT3 y XBP1. Por el contrario, el silenciamiento de MX1 revirtió estas alteraciones. Además, evaluamos el efecto de ERS sobre la apoptosis y la autofagia. Los resultados mostraron que, bajo ERS, la apoptosis y la autofagia aumentaron significativamente. Luego, un segundo análisis bioinformático demostró que el aumento en la expresión de MX1, reduce el riesgo de recaída bioquímica en pacientes con PCa sometida a prostatectomía radical. Al realizar un modelo multivariable en el que se incluyen MX1, HMOX1 y los genes que participan en la vía de ERS (HSPA5, DDIT3, XBP1, ATF4, ATF6, EIF2AK3 y ERN1), ningún gen por si solo pudo explicar la recaída bioquímica, lo que lleva a inferir una correlación estrecha entre estos genes; así, los genes ERS podrían responder a las alteraciones génicas de MX1, que, a su vez, puede ser modulado por HO-1. En resumen, los resultados de este trabajo de tesis identifican a MX1 como un interactor novel de HO-1 y un blanco modulado por HO-1, asociado con procesos ERS en el PCa. MX1 podría inclinar el equilibrio de ERS hacia eventos pro-muerte en la patología prostática maligna, lo que lo convierte en un blanco prometedor para el desarrollo de nuevas terapias. Prostate cancer (PCa) is the second leading cause of cancer death in men worldwide. Localized PCa can be cured in most cases, but when the disease escapes the confines of the gland, the prospects for cure decrease drastically. Androgen ablation is the most effective way of halting PCa progression, but given sufficient time, growth of the cancer resumes in most cases, and the disease becomes “castrate resistant.” No therapy is curative for patients with castrate resistant PCa (CRPC). Thus, there is a critical need for a reliable system to select the best possible anticancer drugs for each patient (individualized patient therapy) in a timely manner. The inflammatory tumor microenvironment is a fertile niche that releases reactive oxygen species ROS, which accelerate the malignant transformation. Heme oxygenase 1 (HO-1), the rate-limiting enzyme in heme degradation, represents an essential event in cellular responses to pro-oxidative and pro-inflammatory insults. We previously reported that HO-1 had a strong anti-tumoral effect in vivo and in vitro, ascertaining it as a logical target for intervention therapy in PCa. Towards this end, we undertook an in-depth mass spectrometry-based proteomics and bioinformatics study to build the HO-1 interactome in PCa, in an effort to identify HO-1 molecular partners, that could explain the biological functions of this protein in this disease, beyond its canonical role. The bioinformatics analysis on the HO-1 interactome protein domains further supported physical interconnectivity among HO-1 interactors. We then assessed the clinical significance of HO-1 molecular partners, using open access cancer-profiling databases. Proteins were clustered into three groups according to their expression profile. In parallel, we carried out an RNA-Seq analysis to compare gene expression profiles between PCa cells overexpressing HO-1 pharmacologically or genetically and their respective controls, to evaluate the ability of HO-1 in regulating the expression at the transcriptional level of the proteins included in these clusters. Taking into account all the information obtained from the different analyzes performed, this thesis focused on the MX1 (myxovirus resistance protein) gene, as results showed: 1) a significant up-regulation of MX1 under HO-1 induction; 2) MX1 was one of the most consistently down-regulated gene in PCa vs. normal prostate and 3) its loss was associated with decreased relapse free survival time in PCa (P≤ 0.05). Of note, there was a significant positive correlation between MX1 and HMOX1 expression in PCa patients. We next validated the implications of HO-1 modulation on MX1 in PCa cells. RT-qPCR and immunofluorescence analyses confirmed significant MX1 increased expression under HO-1 induction. Next, considering that HO-1 is inducible by inflammatory and stress conditions and that is anchored to the endoplasmic reticulum (ER), we analyzed MX1 and HO-1 expression levels in response to ER stress (ERS), using thapsigargin. Results showed significant increase of mRNA expression levels for both genes under ERS. Confirmation of ERS was seen by up-regulation of known markers of this process: HSPA5, DDIT3 and XBP1. Conversely, the silencing of MX1 reversed these effects. Further, we assessed ERS effect on apoptosis and autophagy. Results showed that, under ERS, apoptosis and autophagy increased significantly in PCa. Moreover, an extensive bioinformatics analysis revealed that an increase in the expression of MX1, reduces the risk of biochemical relapse in patients with PCa undergoing radical prostatectomy, and that this relationship is maintained when ERS genes were included in the analyses. However, when making a multivariable model that includes MX1, HMOX1 and all the genes that participate in the ERS pathway (HSPA5, DDIT3, XBP1, ATF4, ATF6, EIF2AK3 and ERN1), no separate gene can explain by itself the biochemical relapse, which leads to infer a close association between these genes. Thus, ERS genes could respond to MX1 gene alterations, which, in turn, can be modulated by HO-1. In summary, we showcase for the first time MX1 as a novel interactor and down-stream target of HO-1, associated with ERS processes in PCa and with a high impact in the clinical setting. MX1 may tilt the balance of ERS towards pro-death events in PCa making it a promising target for novel therapeutic avenues. Fil: Ortiz, Emiliano Germán. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2020-03-11 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6946_Ortiz

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