Diagnóstico molecular de la enfermedad fúngica invasora causada por hongos oportunistas.

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La enfermedad fúngica invasora (EFI) es producida por varias especies de hongos oportunistas; una de las más frecuentes es la aspergilosis invasora (AI) producida por Aspergillus spp. De acuerdo a criterios del EORT/MSG las EFI se clasifican en probada cuando el hongo es observado invadiendo tejido,...

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Autor principal: Refojo, Nicolás
Otros Autores: Canteros, Cristina Elena
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2021
Materias:
ASPERGILOSIS INVASORA
ENFERMEDAD FUNGICA INVASORA
MODELO MURINO DE INFECCION FUNGICA INVASORA
PCR PANFUNGICA
qPCR
INVASIVE ASPERGILLOSIS
INVASIVE FUNGAL DISEASE
MURINE MODEL OF INVASIVE FUNGAL INFECTION
PANFUNGAL PCR
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6833_Refojo
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description La enfermedad fúngica invasora (EFI) es producida por varias especies de hongos oportunistas; una de las más frecuentes es la aspergilosis invasora (AI) producida por Aspergillus spp. De acuerdo a criterios del EORT/MSG las EFI se clasifican en probada cuando el hongo es observado invadiendo tejido, o aislado de biopsias por punción en el paciente; probable cuando el hongo es observado y/o aislado de materiales respiratorios o aspirado de senos paranasales o se detectan galactomananos en el paciente; y posible cuando el paciente solo muestra parámetros clínicos compatibles sin hallazgo micológico. Las EFI poseen alta morbi-mortalidad en pacientes neutropénicos y un diagnóstico rápido y certero aumenta la sobrevida del paciente. El objetivo fue desarrollar y evaluar métodos de detección de ADN fúngico para diagnosticar EFI a partir de diferentes tipos de materiales clínicos. Se estandarizaron dos métodos panfúngicos, basados en la secuenciación del ITS2 (PanPCR) y de una región extendida del 28S del ADNr (Ext28s); y tres métodos rápidos (qPCR) con capacidad de detectar específicamente ADN de Aspergillus spp.: ASP28Po, ASP28Pn y qPCR-AI; las dos primeras diseñadas sobre el 28S del ADNr y la última sobre el ITS2. Se determinó el límite de detección (LOD), especificidad analítica (EA) y su rango dinámico (RD) de cada método. Los mejores rendimientos lo tuvieron la PanPCR (LOD: 10 conidios/mg; EA: 100 % y RD: 10-0.01 ƞg) y la qPCR-AI (LOD: 1 conidios/mg; EA: 88,9% y RD: 10ng-1 fg). La eficacia de detección fúngica de la PanPCR y de la qPCR-AI en comparación con el gold standard (ED/cultivo) fue evaluada en tejidos de ratones inoculados con 5 especies fúngicas causantes de EFI: Asperillus fumigatus, Aspergillus flavus, Fusarium solani species complex, Rhizopus arrhizus y Canddia albicans, mostrando una muy buena concordancia (índice Kappa de 0,83 (IC95% 0,76-0,90) para PanPCR y 0,94 (IC95%: 0,84-1) para qPCR-AI). También se evaluó la eficacia de las combinaciones entre PanPCR, qPCR-AI y con ED/cultivo. Todas las combinaciones mejoraron en algún grado capacidad de detección del ED/cultivo, pero sólo se observó un aumento significativo del 10% (P<0,05) cuando se combinaron los tres métodos (convencional y moleculares), respecto al ED/cultivo. Para determinar los parámetros diagnóstico de la PanPCR y la qPCR-AI se analizaron muestras frescas (respiratorias, sangre, LCR y biopsias) de 166 pacientes y tejidos fijados y parafinados (FFPE) de 47. Según los criterios del EORT/MSG, 69/166 y 47/47 pacientes tenían una EFI probada/probable, respectivamente. Los restantes pacientes tenían una EFI posible o un cuadro clínico que requería un diagnóstico diferencial de EFI. La sensibilidad (S), especificidad (E) y valores predictivos positivo (VPP) y negativo (VPN) de la PanPCR y la qPCR-AI considerando materiales frescos fueron del 71,0%, 91,3%, 86,0% y 80,8%, y del 100,0%, 95,5%, 76,9% y 100,0%, respectivamente. El porcentaje de identificación de agentes fue del 71,0% para el ED/cultivo, y aumentó a un 89,9% combinando el ED/cultivo con PanPCR y qPCR-AI. En tejidos FFPE los valores se S, E, VPP y VPN fueron 100,0%, 91,7%, 88,9% y 100,0% para la qPCR-AI, similar a las de muestras frescas. La PanPCR solo pudo detectar el agente en el 51,1% de los pacientes, estuvo inhibida en 19% y fue negativa en las restantes. El uso combinado de ambos métodos moleculares junto con el ED/cultivo permitió un mejor diagnóstico de las EFIs a partir de muestras frescas. La PanPCR identifica con precisión las diferentes especies de hongos causantes de EFIs, mientras que la qPCR-AI, 100 % sensible y 95 % especifica, permitiría descartar una AI cuando su resultado es negativo (VPN 100%). Si bien la PanPCR fue menos sensible cuando se analizaron tejidos FFPE, sigue siendo un material valioso considerando que a veces es la única posibilidad para arribar a un diagnóstico.
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Molecular diagnostics of invasive fungal disease caused by opportunistic fungi Refojo, Nicolás Canteros, Cristina Elena Iannone, Leopoldo Javier ASPERGILOSIS INVASORA ENFERMEDAD FUNGICA INVASORA MODELO MURINO DE INFECCION FUNGICA INVASORA PCR PANFUNGICA qPCR INVASIVE ASPERGILLOSIS INVASIVE FUNGAL DISEASE MURINE MODEL OF INVASIVE FUNGAL INFECTION PANFUNGAL PCR qPCR La enfermedad fúngica invasora (EFI) es producida por varias especies de hongos oportunistas; una de las más frecuentes es la aspergilosis invasora (AI) producida por Aspergillus spp. De acuerdo a criterios del EORT/MSG las EFI se clasifican en probada cuando el hongo es observado invadiendo tejido, o aislado de biopsias por punción en el paciente; probable cuando el hongo es observado y/o aislado de materiales respiratorios o aspirado de senos paranasales o se detectan galactomananos en el paciente; y posible cuando el paciente solo muestra parámetros clínicos compatibles sin hallazgo micológico. Las EFI poseen alta morbi-mortalidad en pacientes neutropénicos y un diagnóstico rápido y certero aumenta la sobrevida del paciente. El objetivo fue desarrollar y evaluar métodos de detección de ADN fúngico para diagnosticar EFI a partir de diferentes tipos de materiales clínicos. Se estandarizaron dos métodos panfúngicos, basados en la secuenciación del ITS2 (PanPCR) y de una región extendida del 28S del ADNr (Ext28s); y tres métodos rápidos (qPCR) con capacidad de detectar específicamente ADN de Aspergillus spp.: ASP28Po, ASP28Pn y qPCR-AI; las dos primeras diseñadas sobre el 28S del ADNr y la última sobre el ITS2. Se determinó el límite de detección (LOD), especificidad analítica (EA) y su rango dinámico (RD) de cada método. Los mejores rendimientos lo tuvieron la PanPCR (LOD: 10 conidios/mg; EA: 100 % y RD: 10-0.01 ƞg) y la qPCR-AI (LOD: 1 conidios/mg; EA: 88,9% y RD: 10ng-1 fg). La eficacia de detección fúngica de la PanPCR y de la qPCR-AI en comparación con el gold standard (ED/cultivo) fue evaluada en tejidos de ratones inoculados con 5 especies fúngicas causantes de EFI: Asperillus fumigatus, Aspergillus flavus, Fusarium solani species complex, Rhizopus arrhizus y Canddia albicans, mostrando una muy buena concordancia (índice Kappa de 0,83 (IC95% 0,76-0,90) para PanPCR y 0,94 (IC95%: 0,84-1) para qPCR-AI). También se evaluó la eficacia de las combinaciones entre PanPCR, qPCR-AI y con ED/cultivo. Todas las combinaciones mejoraron en algún grado capacidad de detección del ED/cultivo, pero sólo se observó un aumento significativo del 10% (P<0,05) cuando se combinaron los tres métodos (convencional y moleculares), respecto al ED/cultivo. Para determinar los parámetros diagnóstico de la PanPCR y la qPCR-AI se analizaron muestras frescas (respiratorias, sangre, LCR y biopsias) de 166 pacientes y tejidos fijados y parafinados (FFPE) de 47. Según los criterios del EORT/MSG, 69/166 y 47/47 pacientes tenían una EFI probada/probable, respectivamente. Los restantes pacientes tenían una EFI posible o un cuadro clínico que requería un diagnóstico diferencial de EFI. La sensibilidad (S), especificidad (E) y valores predictivos positivo (VPP) y negativo (VPN) de la PanPCR y la qPCR-AI considerando materiales frescos fueron del 71,0%, 91,3%, 86,0% y 80,8%, y del 100,0%, 95,5%, 76,9% y 100,0%, respectivamente. El porcentaje de identificación de agentes fue del 71,0% para el ED/cultivo, y aumentó a un 89,9% combinando el ED/cultivo con PanPCR y qPCR-AI. En tejidos FFPE los valores se S, E, VPP y VPN fueron 100,0%, 91,7%, 88,9% y 100,0% para la qPCR-AI, similar a las de muestras frescas. La PanPCR solo pudo detectar el agente en el 51,1% de los pacientes, estuvo inhibida en 19% y fue negativa en las restantes. El uso combinado de ambos métodos moleculares junto con el ED/cultivo permitió un mejor diagnóstico de las EFIs a partir de muestras frescas. La PanPCR identifica con precisión las diferentes especies de hongos causantes de EFIs, mientras que la qPCR-AI, 100 % sensible y 95 % especifica, permitiría descartar una AI cuando su resultado es negativo (VPN 100%). Si bien la PanPCR fue menos sensible cuando se analizaron tejidos FFPE, sigue siendo un material valioso considerando que a veces es la única posibilidad para arribar a un diagnóstico. Invasive fungal disease (IFD) is caused by several species of opportunistic fungi; one of the most frequent is invasive aspergillosis (AI) caused by Aspergillus spp. According to EORT/MSG criteria, IFD are classified as proven when the fungus is observed invading tissue or isolated from puncture biopsies in the patient; probable when the fungus is observed and/or isolated from respiratory materials or aspirated from paranasal sinuses or galactomannans are detected in the patient; and possible when the patient only shows compatible clinical parameters without mycological finding. IFD have high morbidity and mortality in neutropenic patients and a rapid and accurate diagnosis increases patient survival. The objective was to develop and evaluate fungal DNA detection methods to diagnose IFD from different types of clinical materials. Two panfungal methods were standardized, based on the sequencing of ITS2 (PanPCR) and extended region of 28S of rDNA (Ext28s); and three rapid methods (qPCR) with the ability to specifically detect Aspergillus spp. DNA: ASP28Po, ASP28Pn and qPCR-AI; the first two targeted on 28S and the last on ITS2. Limit of detection (LOD), analytical specificity (EA) and dynamic range (RD) of each method were determined. The best yields were obtained by PanPCR (LOD: 10 conidia / mg; EA: 100% and RD: 10-0.01 ƞg) and qPCR-AI (LOD: 1 conidia / mg; EA: 88.9% and RD: 10ng -1 fg). Efficacy of fungal detection of PanPCR and qPCR-AI in comparison with the gold standard (DE/culture) was evaluated in tissues of mice inoculated with 5 fungal species causing EFI: A. fumigatus, A. flavus, Fusarium solani SC, R. arrhizus and C. albicans, showing a very good agreement (Kappa index of 0.83 (95% CI 0.76-0.90) for PanPCR and 0.94 (95% CI: 0.84-1) for qPCR-IA). Efficacy of combinations between PanPCR, qPCR-AI and DE/culture was also evaluated. All the combinations improved to some degree the detection yield of the DE/culture, but a significant increase of 10% (P> 0.05) was only observed when the three methods (conventional and molecular) were combined, with respect to the DE/culture. To determine the diagnostic parameters of PanPCR and qPCR-AI, fresh samples (respiratory, blood, CSF and biopsies) from 166 patients and fixed and paraffinized tissues (FFPE) from 47 were analyzed. According to the EORT/MSG criteria, 69/166 and 47/47 patients had a proven/probable EFI, respectively. The remaining patients had a possible IFD or a clinical picture that required a differential diagnosis of IFD. The sensitivity, specificity and positive (PPV) and negative (NPV) predictive values of the PanPCR and qPCR-AI considering fresh materials were 71.0%, 91.3%, 86.0% and 80.8%, and 100.0%, 95.5%, 76.9% and 100.0%, respectively. The agent identification percentage was 71.0% for the DE/culture, and increased to 89.9% by combining the DE/culture with PanPCR and qPCR-AI. In FFPE tissues, the S, E, PPV and NPV values were 100.0%, 91.7%, 88.9% and 100.0% for qPCR-AI, similar to those of fresh samples. PanPCR was only able to detect the agent in 51.1% of the patients, it was inhibited in 19%, and it was negative in the remainder. The combined use of both molecular methods together with the DE/culture allowed a better diagnosis of the EFIs from fresh samples. PanPCR accurately identifies the different species of fungi that cause EFIs, while qPCR-AI, 100% sensitive and 95% specific, would allow ruling out AI when its result is negative (NPV 100%). Although PanPCR was less sensitive when FFPE tissues were analyzed, it is still a valuable material considering that it is sometimes the only possibility to arrive at a diagnosis. Fil: Refojo, Nicolás. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2021-04-12 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6833_Refojo

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