La regulación epigenética de CLCA2 por CtBP1, HDACs, ZEB1, p300 y miR-196b-5p impacta en la adhesión celular y la transición epitelio mesenquimal del cáncer de próstata asociado al síndrome metabólico

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El cáncer de próstata (PCa) es el cáncer más prevalente entre hombres y la sexta causa de muerte por cáncer en el mundo, mientras que en Argentina es el cáncer con mayor incidencia y el tercero en mortalidad. Por lo tanto, continúa siendo uno de los problemas más importantes de la salud pública. Los...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Porretti, Juliana Carla
Otros Autores:	De Siervi, Adriana
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2018
Materias:	CANCER DE PROSTATA SINDROME METABOLICO CTBP1 CLCA2 MIR-196B-5P PROSTATE CANCER METABOLIC SYNDROME MIR-196-5P
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6310_Porretti
Aporte de:	Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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En los últimos años el estudio del papel del SM en la incidencia y progresión del PCa ha arrojado resultados controversiales; sin embargo, un trabajo reciente basado en un meta-análisis concluyó que el SM está asociado con un peor pronóstico de los pacientes con PCa, un aumento de la agresividad del tumor y una mayor tasa de recurrencia. Trabajos previos de nuestro grupo acerca de C-terminal binding protein 1 (CTBP1) muestran una posible explicación molecular para estas asociaciones. CTBP1 es un co-represor transcripcional de genes supresores tumorales que es activado por su unión al NAD+ o al NADH. En nuestro laboratorio utilizando un modelo animal de SM determinamos que el silenciamiento de la expresión de CTBP1 en xenotransplantes disminuyó drásticamente el crecimiento tumoral de mama y de próstata respecto a la condición control. Asimismo, a través de un microarreglo obtuvimos el perfil de expresión de mRNA de los xenotransplantes de próstata. Un análisis por GSEA de los mismos detectó que CTBP1 modula genes pertenecientes a la vía olfatoria, entre los cuales se encuentra la proteína accesoria al canal de cloro 2 (CLCA2). CLCA2 es una proteína de transmembrana de tipo I propuesta como un posible supresor tumoral en cáncer de mama y cáncer colorrectal. Asimismo Tanikawa y et al. reportaron que la expresión de CLCA2 se encontraba disminuida en cáncer de próstata, vejiga, esófago y pulmón comparado con tejido normal. El grupo de Elble, colaborador de nuestro grupo, demostró que CLCA2 se encuentra involucrada en los procesos de proliferación y transición epitelio mesenquimal (EMT) en cáncer de mama. Sin embargo el rol de CLCA2 en PCa no ha sido estudiado. Por otro lado, los microRNAs (miRNAs) son moléculas pequeñas de RNA no-codificantes que tienen un rol crucial como regulador de la expresión génica. Cada miRNA tiene como blanco múltiples mRNAs, por lo cual la modulación de un mismo miRNA puede alterar la expresión de importantes procesos. Asimismo, estas moléculas se están evaluando como posibles biomarcadores diagnósticos y pronósticos como también como blancos y/o agentes terapéuticos por lo que su estudio es de gran relevancia. En base a estos antecedentes el objetivo general de este proyecto fue conocer los mecanismos moleculares por los cuales CTBP1 media la asociación entre el SM y el desarrollo y la progresión del PCa. En este trabajo de tesis en primer lugar validamos el resultado del microarreglo de expresión y observamos que CTBP1 reprime la expresión de CLCA2 en xenotransplantes de próstata desarrollados en animales con SM. Detectamos que CTBP1 interacciona físicamente con el promotor de CLCA2 reprimiendo su transcripción en líneas de PCa. Asimismo, al utilizar un panel de plásmidos que tienen clonados distintos fragmentos del promotor de CLCA2 río arriba del gen de la luciferasa, determinamos que CTBP1 es capaz de modular la actividad del promotor de CLCA2 independientemente del largo del fragmento presente. Más aún, utilizando un panel de factores de transcripción y moduladores de la cromatina, encontramos que CTBP1 corregula en conjunto con ZEB1, EP300 y HDACs la actividad del promotor de CLCA2 en células de PCa. Estudiando la función de CLCA2 en el PCa, encontramos que esta proteína promueve la adhesión celular de líneas de PCa inhibiendo la EMT. Asimismo, la actividad de CTNNB1en el núcleo disminuyó en presencia de CLCA2 con la concomitante inducción de la expresión del marcador epitelial CDH1 y la represión de los marcadores mesenquimales SNAI2 y TWIST1. A partir de la sangre periférica de ratones con SM y xenostransplantes generados con líneas celulares control o la expresión de CLCA2 disminuida de forma estable, seleccionamos Células Tumorales Circulantes (CTCs) y realizamos un ensayo clonogénico. Encontramos que la disminución de la expresión de CLCA2 aumentó el porcentaje de ratones con focos de CTCs comparados con los ratones control. Además, realizamos un microarreglo de expresión de miRNAs de los tumores xenotransplantados de próstata generados en ratones con SM. Luego del análisis obtuvimos 21 miRNAs modulados por CTBP1 que se encuentran involucrados en los procesos de angiogénesis, organización de la matriz extracelular, biología del desarrollo; y, en vías de señalización del cáncer, adhesiones focales, uniones adherentes, entre otros. Un análisis supervisado en base a herramientas bioinformáticas y bibliografía identificó al miR-196b-5p como un miRNA que potencialmente regula a CLCA2 y podría tener un papel interesante en el PCa. Validamos los resultados del microarreglo determinando que CTBP1 induce la expresión de miR-196b-5p en condiciones de SM. Asimismo, clonamos el 3’UTR de CLCA2 en un plásmido reportero y logramos identificar a CLCA2 como un blanco directo del miR-196b-5p. Por último, determinamos que el miR-196b-5p inhibe la adhesión celular. Estos resultados nos permiten identificar un nuevo mecanismo molecular que explica la asociación del PCa y el SM basados en CTBP1. Así, esta proteína regula directamente a CLCA2 y el miR-196b-5p los cuales actuarían como factores claves en el inicio de la progresión de esta enfermedad.
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Los factores de riesgo establecidos para esta enfermedad son la edad, la raza y la historia familiar, sin embargo la dieta y el estilo de vida son factores claves en la biología del PCa y su tumorigénesis. El síndrome metabólico (SM) es un estado fisiopatológico que involucra al menos tres de los siguientes factores: obesidad abdominal, triglicéridos elevados, colesterol elevado, hipertensión y/o intolerancia a la glucosa. En los últimos años el estudio del papel del SM en la incidencia y progresión del PCa ha arrojado resultados controversiales; sin embargo, un trabajo reciente basado en un meta-análisis concluyó que el SM está asociado con un peor pronóstico de los pacientes con PCa, un aumento de la agresividad del tumor y una mayor tasa de recurrencia. Trabajos previos de nuestro grupo acerca de C-terminal binding protein 1 (CTBP1) muestran una posible explicación molecular para estas asociaciones. CTBP1 es un co-represor transcripcional de genes supresores tumorales que es activado por su unión al NAD+ o al NADH. En nuestro laboratorio utilizando un modelo animal de SM determinamos que el silenciamiento de la expresión de CTBP1 en xenotransplantes disminuyó drásticamente el crecimiento tumoral de mama y de próstata respecto a la condición control. Asimismo, a través de un microarreglo obtuvimos el perfil de expresión de mRNA de los xenotransplantes de próstata. Un análisis por GSEA de los mismos detectó que CTBP1 modula genes pertenecientes a la vía olfatoria, entre los cuales se encuentra la proteína accesoria al canal de cloro 2 (CLCA2). CLCA2 es una proteína de transmembrana de tipo I propuesta como un posible supresor tumoral en cáncer de mama y cáncer colorrectal. Asimismo Tanikawa y et al. reportaron que la expresión de CLCA2 se encontraba disminuida en cáncer de próstata, vejiga, esófago y pulmón comparado con tejido normal. El grupo de Elble, colaborador de nuestro grupo, demostró que CLCA2 se encuentra involucrada en los procesos de proliferación y transición epitelio mesenquimal (EMT) en cáncer de mama. Sin embargo el rol de CLCA2 en PCa no ha sido estudiado. Por otro lado, los microRNAs (miRNAs) son moléculas pequeñas de RNA no-codificantes que tienen un rol crucial como regulador de la expresión génica. Cada miRNA tiene como blanco múltiples mRNAs, por lo cual la modulación de un mismo miRNA puede alterar la expresión de importantes procesos. Asimismo, estas moléculas se están evaluando como posibles biomarcadores diagnósticos y pronósticos como también como blancos y/o agentes terapéuticos por lo que su estudio es de gran relevancia. En base a estos antecedentes el objetivo general de este proyecto fue conocer los mecanismos moleculares por los cuales CTBP1 media la asociación entre el SM y el desarrollo y la progresión del PCa. En este trabajo de tesis en primer lugar validamos el resultado del microarreglo de expresión y observamos que CTBP1 reprime la expresión de CLCA2 en xenotransplantes de próstata desarrollados en animales con SM. Detectamos que CTBP1 interacciona físicamente con el promotor de CLCA2 reprimiendo su transcripción en líneas de PCa. Asimismo, al utilizar un panel de plásmidos que tienen clonados distintos fragmentos del promotor de CLCA2 río arriba del gen de la luciferasa, determinamos que CTBP1 es capaz de modular la actividad del promotor de CLCA2 independientemente del largo del fragmento presente. Más aún, utilizando un panel de factores de transcripción y moduladores de la cromatina, encontramos que CTBP1 corregula en conjunto con ZEB1, EP300 y HDACs la actividad del promotor de CLCA2 en células de PCa. Estudiando la función de CLCA2 en el PCa, encontramos que esta proteína promueve la adhesión celular de líneas de PCa inhibiendo la EMT. Asimismo, la actividad de CTNNB1en el núcleo disminuyó en presencia de CLCA2 con la concomitante inducción de la expresión del marcador epitelial CDH1 y la represión de los marcadores mesenquimales SNAI2 y TWIST1. A partir de la sangre periférica de ratones con SM y xenostransplantes generados con líneas celulares control o la expresión de CLCA2 disminuida de forma estable, seleccionamos Células Tumorales Circulantes (CTCs) y realizamos un ensayo clonogénico. Encontramos que la disminución de la expresión de CLCA2 aumentó el porcentaje de ratones con focos de CTCs comparados con los ratones control. Además, realizamos un microarreglo de expresión de miRNAs de los tumores xenotransplantados de próstata generados en ratones con SM. Luego del análisis obtuvimos 21 miRNAs modulados por CTBP1 que se encuentran involucrados en los procesos de angiogénesis, organización de la matriz extracelular, biología del desarrollo; y, en vías de señalización del cáncer, adhesiones focales, uniones adherentes, entre otros. Un análisis supervisado en base a herramientas bioinformáticas y bibliografía identificó al miR-196b-5p como un miRNA que potencialmente regula a CLCA2 y podría tener un papel interesante en el PCa. Validamos los resultados del microarreglo determinando que CTBP1 induce la expresión de miR-196b-5p en condiciones de SM. Asimismo, clonamos el 3’UTR de CLCA2 en un plásmido reportero y logramos identificar a CLCA2 como un blanco directo del miR-196b-5p. Por último, determinamos que el miR-196b-5p inhibe la adhesión celular. Estos resultados nos permiten identificar un nuevo mecanismo molecular que explica la asociación del PCa y el SM basados en CTBP1. Así, esta proteína regula directamente a CLCA2 y el miR-196b-5p los cuales actuarían como factores claves en el inicio de la progresión de esta enfermedad. Prostate cancer (PCa) is the most prevalent cancer among men and the sixth leading cause of cancer death in the world, while in Argentina it is the cancer with the highest incidence and the third in mortality. Thus, it is one of the most important public health problems. The established risk factors for this disease are age, race, and family history; however diet and lifestyle play a crucial role in PCa biology and tumorigenesis. Metabolic syndrome (MeS) is a cluster of pathophysiological disorders that comprises at least three of the following factors: abdominal obesity, elevated triglycerides, high cholesterol, high blood pressure and impaired glucose. In the last years the MeS role in PCa incidence and progression has been studied with different outcomes; nonetheless recently a meta-analysis revealed that this disease is associated to poor PCa patient prognosis, increased tumor aggressiveness and biochemical recurrence. Previously, our group proposed to C-terminal binding protein 1 (CTBP1) as a molecular link among these two conditions. CTBP1 is a transcripcional co-repressor of tumor suppressor genes activated by its binding to NAD+ or NADH. We generated a MeS mice model and established that CTBP1 depletion in xenografts dramatically decreased tumor growth in breast and prostate cancer. Also, by mRNA microarrays we obtained the gene profile modulated by CTBP1 in the PCa xenografts. A GSEA analysis revealed that CTBP1 modulates genes from the olfactory pathway including Chloride Channel Accessory 2 (CLCA2). CLCA2 is a type I integral transmembrane protein. It was proposed as a tumor suppressor in breast and colorectal cancer. Tanikawa et al. found that CLCA2 expression was remarkably decreased in prostate, breast, bladder, esophageal and lung cancers compared to normal tissues. Elble´s group, collaborator of our work, showed that CLCA2 was involved in proliferation and epithelial-mesenchymal transition (EMT) in breast cancer. However, CLCA2 role in PCa was not studied. The microRNAs (miRNAs) are small non-coding RNA molecules and key factors in the gene expression regulation. Each miRNA targets multiple mRNAs, whereby the modulation of one miRNA can alter the expression of important processes. Likewise, these molecules are being evaluated as possible diagnostic and prognostic biomarkers as well as target and/or therapeutic agents, so their study is of great relevance. Based on this evidence, the general aim of this project was to investigate the molecular mechanisms by which CTBP1 mediates the association between MeS and PCa development and progression. In this thesis we first validated microarray results and observed that CTBP1 represses CLCA2 expression in prostate xenografts developed in animals with MeS. We detected that CTBP1 bound to CLCA2 promoter and repressed its transcription in PCa cell lines. Using reporter constructs with different length of CLCA2 promoter regions cloned upstream of the luciferase gene; we determined that CTBP1 was able to modulate CLCA2 promoter activity in all cases. Furthermore, using a panel of transcription factors and chromatin modulators, we find that CTBP1 co-regulates with ZEB1, EP300 and HDACs the CLCA2 promoter activity in PCa cells. To study the CLCA2 role in PCa, we found that this protein promoted PCa cell adhesion inhibiting EMT. Moreover, we observed that CLCA2 overexpression decreased CTNNB1 activity in the nucleus together with CDH1 induction, an epithelial marker, and SNAI2 and TWIST1 repression, mesenchymal markers. From the peripheral blood of mice with MeS and PCa xenografts generated with CLCA2 depleted or control cell lines, we selected Circulating Tumor Cells (CTCs) and performed a clonogenic assay. We found that CLCA2 depletion increased the percentage of mice with CTCs foci compared to control mice. Furthermore, we performed a miRNA expression microarray from PCa xenografts developed in MeS mice. We obtained 21 miRNAs modulated by CTBP1 involved in the processes of angiogenesis, extracellular matrix organization, development biology and, in pathways of cancer, focal adhesion and adherent junction among others. A supervised analysis based on bioinformatic tools and literature identified to miR-196b-5p as a miRNA that potentially regulates CLCA2 and may play an interesting role in PCa. We validated microarray results by determining that CTBP1 induced miR-196b-5p expression under MeS conditions. We also cloned the CLCA2 3'UTR in a reporter plasmid that let us to identify CLCA2 as a direct target of miR-196b-5p. Finally, we determined that miR-196b-5p inhibits cell adhesion. These results allow us to identify a new molecular mechanism that explains the PCa and MeS link based on CTBP1. Thus, this protein directly regulates CLCA2 and miR-196b-5p molecules that might act as key factors in the progression onset of this disease. Fil: Porretti, Juliana Carla. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2018-03-19 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6310_Porretti

La regulación epigenética de CLCA2 por CtBP1, HDACs, ZEB1, p300 y miR-196b-5p impacta en la adhesión celular y la transición epitelio mesenquimal del cáncer de próstata asociado al síndrome metabólico

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