Interacción entre geometría y dinámica en la modulación de señales intracelulares de calcio
Las señales de Ca²⁺ son ubicuas y juegan un rol importante en numerosos procesosfisiológicos como la fertilización o la muerte celular. Su versatilidad se basa en la variedadde comportamientos espacio-temporales que puede mostrar la concentración de calciointracelular y en que distintos comportamien...
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| Formato: | Tesis doctoral publishedVersion |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
2016
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Las señales de Ca²⁺ son ubicuas y juegan un rol importante en numerosos procesosfisiológicos como la fertilización o la muerte celular. Su versatilidad se basa en la variedadde comportamientos espacio-temporales que puede mostrar la concentración de calciointracelular y en que distintos comportamientos pueden inducir respuestas diferentes. La liberación de Ca²⁺ desde el retículo endoplasmático (RE) hacia el citosol a travésde receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (RIP3s) es una componente clave dentro de losmecanismos de señalización por Ca²⁺. Los RIP3s necesitan unir IP3 y Ca²⁺ para abrirsepor lo que la liberación de Ca²⁺ a través de un único RIP3 puede inducir la apertura deotros canales vecinos, mecanismo que se conoce como liberación de calcio inducida porcalcio o CICR por las siglas en inglés. Los RIP3s aparentemente se organizan en cúmulossobre la membrana del RE (clusters). Si el CICR se encuentra limitado a un cluster, lasseñales pueden permanecer localizadas (puffs). En caso contrario, pueden convertirse enondas que se propagan entre clusters. Los puffs son los ladrillos de construcción de esasseñales más globales que se propagan por toda la célula. Por este motivo, existe un graninterés en la determinación de las propiedades de los puffs, especialmente en vista dela actual controversia sobre la distribución espacial de los RIP3s activables. Las señalesde calcio, por otro lado, pueden remodelarse a través de varios mecanismos, entre ellos,el atrapado del Ca²⁺ por parte de buffers. Éstos no sólo disminuyen la concentraciónde Ca²⁺ libre sino que modifican su distribución espacio-temporal de distintos modosdependiendo de su cinética. Los puffs de Ca²⁺ se han observado en células intactas con técnicas ópticas mostrandoque son intrínsecamente estocásticos. La obtención de una imagen correcta dela dinámica de los eventos entonces implica ser capaz de detectar todo el rango de tama~nos de puffs. Éstos se observan usando indicadores de Ca²⁺ de una longitud de ondavisible y buffers exógenos lentos (por ej; EGTA) para disrumpir el CICR entre clusters. Los indicadores de única longitud de onda aumentan su uorescencia al ligar calcio. De esta manera, generan imágenes que dependen fuertemente de su cinética, transportey propiedades fotofísicas. Por este motivo, es de particular importancia determinar losartefactos que generan las condiciones del experimento. La propia existencia de los puffs depende de que los RIP3s están organizados encúmulos. Una distribución uniforme de receptores debería dar lugar típicamente a señalespropagantes tipo ondas. Los ovocitos de Xenopus laevis son un sistema experimentalventajoso para estudiar estas señales. Durante la fertilización se evoca una onda de Ca²⁺ que se propaga por toda la célula. La fertilización ocurre en el huevo maduro. Se ha observado que, al madurar el ovocito, su RE se configura y la distribución delos RIP3s parece ser más uniforme. Esto tiene un correlato en las características de lasseñales evocadas en los ovocitos maduros. En esta Tesis se combinaron experimentos, un análisis teórico y simulaciones numéricaspara evaluar de qué modo la geometría de la distribución de canales se combina conalguno de los otros aspectos que inuyen sobre la distribución de calcio libre para determinarlas características de las señales. El primer aporte fue introducir un métodoque permite establecer clases equivalentes de experimentos de obtención de imágenesrealizados en condiciones diferentes, donde la clase está determinada por la relaciónseñal-ruido que predice el método. Éste también puede utilizarse para estimar el tamaño de las señales más pequeñas que pueden observarse de manera confiable con cadaarreglo y para generar imágenes de uorescencia numéricamente con ruido realista. Esta Tesis también contribuyó a estudiar si la presencia del indicador o del EGTA en distintascondiciones experimentales altera la dinámica intracelular de Ca²⁺, en particular,analizar si son capaces de detectar puffs de Ca²⁺ con similar precisión y de qué modo lasdistintas configuraciones experimentales afectan las propiedades de los puffs observadosy la dinámica del Ca²⁺ subyacente. Se pudo determinar que aunque el indicador o el EGTA no alteran la dinámica intracluster del Ca²⁺, el conjunto de eventos observablesdel experimento es diferente dependiendo del grado de acoplamiento entre clusters. Elestudio, por otro lado, permitió inferir que los puffs con mayor liberación de Ca²⁺ provienende cúmulos donde los RIP3s están muy cerca unos de otros. Para estudiar enmás detalle la disrupción del CICR entre clusters vecinos que inducen los buffers lentos,se realizaron experimentos utilizando simultáneamente dos indicadores de calcio de distintacinética. Utilizando el método introducido pudimos confirmar nuestra conclusiónprevia sobre cómo se modifica el conjunto de eventos que se evoca en presencia de bufferslentos. Por otro lado, determinamos que la presencia de buffers rápidos da lugar a liberacionesde Ca²⁺ más prolongadas tal vez debido a que reducen el efecto inhibidor del Ca²⁺ sobre los RIP3s. En relación a la razón por la que los buffers lentos disrumpen elacoplamiento entre clusters pudimos concluir que su presencia disminuye el Ca²⁺ basal,aunque no tanto como para explicar la disrupción. El análisis de la diferente distribuciónespacio-temporal de los buffers lentos y rápidos parecería indicar la presencia de RIP3sen el espacio entre clusters que podrían ser "silenciados" por los buffers lentos evitandoasí la propagación de las señales entre cúmulos. Finalmente, en la Tesis se han mostradotambién resultados preliminares de señales de calcio que se observan en células maduradas,cuyos cambios pueden explicarse en términos de una distribución espacial distintade RIP3s. |
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tesis:tesis_n5977_Piegari2023-10-02T20:13:23Z Interacción entre geometría y dinámica en la modulación de señales intracelulares de calcio Interaction of geometry and dynamics on the modulation of intracellular calcium signals Piegari, Estefanía Ponce Dawson, Silvina SEÑALES INTRACELULARES DE CALCIO RECEPTORES DE IP3 DINAMICA ESPACIO-TEMPORAL MICROSCOPIA CONFOCAL FLUCTUACIONES DE LA FLUORESCENCIA INTRACELLULAR CALCIUM SIGNALS IP3 RECEPTORS SPATIO-TEMPORAL DYNAMICS CONFOCAL MICROSCOPY FLUORESCENCE FLUCTUATIONS Las señales de Ca²⁺ son ubicuas y juegan un rol importante en numerosos procesosfisiológicos como la fertilización o la muerte celular. Su versatilidad se basa en la variedadde comportamientos espacio-temporales que puede mostrar la concentración de calciointracelular y en que distintos comportamientos pueden inducir respuestas diferentes. La liberación de Ca²⁺ desde el retículo endoplasmático (RE) hacia el citosol a travésde receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (RIP3s) es una componente clave dentro de losmecanismos de señalización por Ca²⁺. Los RIP3s necesitan unir IP3 y Ca²⁺ para abrirsepor lo que la liberación de Ca²⁺ a través de un único RIP3 puede inducir la apertura deotros canales vecinos, mecanismo que se conoce como liberación de calcio inducida porcalcio o CICR por las siglas en inglés. Los RIP3s aparentemente se organizan en cúmulossobre la membrana del RE (clusters). Si el CICR se encuentra limitado a un cluster, lasseñales pueden permanecer localizadas (puffs). En caso contrario, pueden convertirse enondas que se propagan entre clusters. Los puffs son los ladrillos de construcción de esasseñales más globales que se propagan por toda la célula. Por este motivo, existe un graninterés en la determinación de las propiedades de los puffs, especialmente en vista dela actual controversia sobre la distribución espacial de los RIP3s activables. Las señalesde calcio, por otro lado, pueden remodelarse a través de varios mecanismos, entre ellos,el atrapado del Ca²⁺ por parte de buffers. Éstos no sólo disminuyen la concentraciónde Ca²⁺ libre sino que modifican su distribución espacio-temporal de distintos modosdependiendo de su cinética. Los puffs de Ca²⁺ se han observado en células intactas con técnicas ópticas mostrandoque son intrínsecamente estocásticos. La obtención de una imagen correcta dela dinámica de los eventos entonces implica ser capaz de detectar todo el rango de tama~nos de puffs. Éstos se observan usando indicadores de Ca²⁺ de una longitud de ondavisible y buffers exógenos lentos (por ej; EGTA) para disrumpir el CICR entre clusters. Los indicadores de única longitud de onda aumentan su uorescencia al ligar calcio. De esta manera, generan imágenes que dependen fuertemente de su cinética, transportey propiedades fotofísicas. Por este motivo, es de particular importancia determinar losartefactos que generan las condiciones del experimento. La propia existencia de los puffs depende de que los RIP3s están organizados encúmulos. Una distribución uniforme de receptores debería dar lugar típicamente a señalespropagantes tipo ondas. Los ovocitos de Xenopus laevis son un sistema experimentalventajoso para estudiar estas señales. Durante la fertilización se evoca una onda de Ca²⁺ que se propaga por toda la célula. La fertilización ocurre en el huevo maduro. Se ha observado que, al madurar el ovocito, su RE se configura y la distribución delos RIP3s parece ser más uniforme. Esto tiene un correlato en las características de lasseñales evocadas en los ovocitos maduros. En esta Tesis se combinaron experimentos, un análisis teórico y simulaciones numéricaspara evaluar de qué modo la geometría de la distribución de canales se combina conalguno de los otros aspectos que inuyen sobre la distribución de calcio libre para determinarlas características de las señales. El primer aporte fue introducir un métodoque permite establecer clases equivalentes de experimentos de obtención de imágenesrealizados en condiciones diferentes, donde la clase está determinada por la relaciónseñal-ruido que predice el método. Éste también puede utilizarse para estimar el tamaño de las señales más pequeñas que pueden observarse de manera confiable con cadaarreglo y para generar imágenes de uorescencia numéricamente con ruido realista. Esta Tesis también contribuyó a estudiar si la presencia del indicador o del EGTA en distintascondiciones experimentales altera la dinámica intracelular de Ca²⁺, en particular,analizar si son capaces de detectar puffs de Ca²⁺ con similar precisión y de qué modo lasdistintas configuraciones experimentales afectan las propiedades de los puffs observadosy la dinámica del Ca²⁺ subyacente. Se pudo determinar que aunque el indicador o el EGTA no alteran la dinámica intracluster del Ca²⁺, el conjunto de eventos observablesdel experimento es diferente dependiendo del grado de acoplamiento entre clusters. Elestudio, por otro lado, permitió inferir que los puffs con mayor liberación de Ca²⁺ provienende cúmulos donde los RIP3s están muy cerca unos de otros. Para estudiar enmás detalle la disrupción del CICR entre clusters vecinos que inducen los buffers lentos,se realizaron experimentos utilizando simultáneamente dos indicadores de calcio de distintacinética. Utilizando el método introducido pudimos confirmar nuestra conclusiónprevia sobre cómo se modifica el conjunto de eventos que se evoca en presencia de bufferslentos. Por otro lado, determinamos que la presencia de buffers rápidos da lugar a liberacionesde Ca²⁺ más prolongadas tal vez debido a que reducen el efecto inhibidor del Ca²⁺ sobre los RIP3s. En relación a la razón por la que los buffers lentos disrumpen elacoplamiento entre clusters pudimos concluir que su presencia disminuye el Ca²⁺ basal,aunque no tanto como para explicar la disrupción. El análisis de la diferente distribuciónespacio-temporal de los buffers lentos y rápidos parecería indicar la presencia de RIP3sen el espacio entre clusters que podrían ser "silenciados" por los buffers lentos evitandoasí la propagación de las señales entre cúmulos. Finalmente, en la Tesis se han mostradotambién resultados preliminares de señales de calcio que se observan en células maduradas,cuyos cambios pueden explicarse en términos de una distribución espacial distintade RIP3s. Ca²⁺ signals are ubiquitous and play a relevant role in numerous physiologicalprocesses as fertilization or cell death. Their versatility relies on the variety of spatiotemporalbehaviors that the intracellular calcium concentration can display and that differentbehaviors can induce different end responses. Ca²⁺ release from the endoplasmicreticulum (ER) into the cytosol through inositol 1,4,5-trisphosphate receptors (IP3Rs)is a key component of the Ca²⁺ signaling toolkit. IP3Rs need to bind IP3 and Ca²⁺to become open an therefore. Therefore, Ca²⁺ released through one open IP3R can inducethe opening of neighboring ones, a mechanism that is knwon as Calcium Induced Calcium Release (CICR). IP3Rs are apparently organized in clusters. The signals canremain localized (i.e., Ca²⁺ puffs) if CICR is limited to one cluster or become wavesthat propagate between clusters. Puffs are the building blocks of global signals that propagatethroughout the cell. Thus, there is great interest in determining puff properties,especially in view of the current controversy on the spatial distribution of activatable IP3Rs. Moreover, calcium signals can be remodeled through various mechanisms, suchas Ca²⁺ buffers. Buffers not only decrease the concentration of free Ca²⁺ but also modifyits spatial and temporal distribution in different ways depending on their kinetics. Ca²⁺ puffs have been observed in intact cells using optical techniques showing thatthey are intrinsically stochastic. Obtaining a correct picture of their dynamics then entailsbeing able to detect the whole range of puff sizes. Puffs are usually observed usingvisible single-wavelength dyes and slow exogenous buffers (e.g., EGTA) to disrupt intercluster CICR. Single-wavelength dyes increase their uorescence upon calcium bindingproducing images that are strongly dependent on their kinetic, transport and photophysicalproperties. Thus, determining the artifacts that the imaging setting introduces isparticularly relevant. The very existence of puffs depends on the fact that IP3Rs are organized in clusters. A uniform distribution of receptors should typically lead to waves-like (propagating)signals. Xenopus laevis oocytes are an advantageous biological system to study thesesignals since Ca²⁺ release from the ER only occurs through IP3Rs. During fertilizationa Ca²⁺ wave that propagates throughout the cell is evoked. Fertilization occurs in themature egg. It has been observed that maturation of the oocyte induces a reorganizationof the ER whereas IP3Rs seem to be distributed more uniformly on its membrane. Thishas its counterpart on the properties of the Ca²⁺ signals that are evoked in matureoocytes. In this Thesis we have combined experiments, theoretical analyses and numericalsimulations to evaluate in which ways the geometry of the channel distributions interactswith the other aspects that affect the intracellular Ca²⁺ dynamics to determine thecharacteristics of the signals. The first contribution of this Thesis was to introduce amethod that establishes equivalence classes of Ca²⁺ imaging experimental conditions,where the class is determined by the signal-to-noise ratio that is predicted by the method. The method can also be used to estimate the smallest signals that can reliablybe observed with each experimental setting and to produce numerically generated Ca²⁺images with realistic noise. The Thesis also contributed to study to what extent experimentsperformed with different dyes and/or [EGTA] alter the intracellular Ca²⁺dynamics, in particular, if they are able to detect Ca²⁺ puffs with similar accuracy andin which ways the different experimental conditions affect the observed puff propertiesor the underlying dynamics of Ca²⁺ itself. We could determine that, although the dyeor EGTA does not alter the intra-cluster dynamics, the set of observable events is differentdepending on the degree of inter-cluster coupling/uncoupling that is induced bythe experimental conditions. An analysis of the observations allowed us to show thatthe events with the largest amounts of released Ca²⁺ came from clusters with denselypacked active IP3Rs. To study in more detail the way in which slow buffers disrupt theinter-cluster CICR experiments were performed using two calcium dyes of different kineticssimultaneously. Applying the method introduced previously in the Thesis we couldconfirm our previous conclusion on how the set of events that is evoked is modified in thepresence of slow buffers. We determined that the presence of fast buffers, on the otherhand, results in longer periods of Ca²⁺ release perhaps because they reduce the inhibitoryeffect of Ca²⁺ on IP3Rs. With respect to the way in which the slow buffers disruptthe inter-cluster coupling we could conclude that their presence decreases basal Ca²⁺,although not enough to explain the disruption. The analysis of the different spatial andtemporal distribution of Ca²⁺ bound to slow and fast buffers that is observed in theexperiments seems to indicate that there are IP3Rs in the space between clusters thatcould be silenced by the slow buffers thus preventing the propagation of signals betweenclusters. Finally, in the Thesis we have also shown preliminary results on calcium signalsobserved in mature cells, whose changes can be explained in terms of a different spatialdistribution of IP3Rs with respect to the case of immature oocytes. Fil: Piegari, Estefanía. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2016-03-30 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5977_Piegari |