Desarrollo de nuevas estrategias antimicrobianas : silenciamiento de genes bacterianos mediante tecnología antisentido

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La emergencia de enfermedades infecciosas causadas por bacterias multiresistentesy la falta de antibióticos para su tratamiento constituyen una amenazapara la salud global. Ante la necesidad de desarrollo de nuevos antimicrobianos seha considerado la posibilidad de emplear técnicas de silenciamiento...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor principal: Davies Sala, Carol G.
Otros Autores: Zorreguieta, Ángeles
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2016
Materias:
RIBOZIMA P
ANTIMICROBIANOS
SILENCIAMIENTO GENICO
TECNOLOGIA ANTISENTIDO
FTSZ
ACINETOBACTER BAUMANNII
RIBOZYME P
ANTIMICROBIAL
GENE SILENCING
ANTISENSE TECHNOLOGY
GRAM NEGATIVE
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5940_DaviesSala
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description La emergencia de enfermedades infecciosas causadas por bacterias multiresistentesy la falta de antibióticos para su tratamiento constituyen una amenazapara la salud global. Ante la necesidad de desarrollo de nuevos antimicrobianos seha considerado la posibilidad de emplear técnicas de silenciamiento génicomediado por ARNs antisentido. Una de estas estrategias de silenciamiento es ladenominada tecnología EGS, que se encuentra mediada por la Ribozima P o ARNasa P, una ribozima presente en todos los dominios y que en bacterias Gramnegativas está conformada por una subunidad ARN-catalítica y por otra proteica. La ARNasa P participa en la maduración de los ARN de transferencia generando elextremo 5´ maduro por un corte simple endonucleolítico de su precursor. Esta propiedad puede emplearse para mediar el corte de una molécula de ARN blanco - cuya expresión quiera ser silenciada- en presencia de un oligorribonucleótido complementario, conocido como External Guide Sequence (EGS).Una vez formado el dúplex ARN blanco : EGS, este complejo puede ser reconocido por la ARNasa Pcomo sustrato y entonces promover el corte endonucleolítico del ARN blanco,inactivándolo. El objetivo global en el que se enmarca este trabajo de tesisconsiste en evaluar estrategias de silenciamiento génico mediante tecnologíaantisentido como posibles antimicrobianos o para prolongar el uso de losantibióticos ya existentes. En este trabajo de tesis doctoral se exploró la posibilidad de inhibir laexpresión de genes bacterianos a través del uso de tecnología EGS antisentido. Inicialmente se trabajó con cepas de Escherichia coli y como blanco se eligió al ARN mensajero del gen ftsZ cuyo producto, la proteína FtsZ es un análogobacteriano de la tubulina y esencial para la división celular. Tanto la expresión deestos pequeños ARNs antisentido dirigidos contra el mensajero ftsZ como laadministración exógena de análogos de ácidos nucleicos no hidrolizables pornucleasas bacterianas, generaron una inhibición de la división celular, originandoun cambio en la morfología de las bacterias y una disminución de la viabilidad delas células tratadas. Estos resultados apoyan la idea que los EGSs dirigidos contragenes vitales bacterianos podrían considerarse como potenciales antimicrobianos. Con la intención de explorar la aplicación de esta tecnología desilenciamiento génico a una especie bacteriana de importancia clínica creciente, selogró identificar, clonar, transcribir y purificar los componentes de la ribozima Pde Acinetobacter baumannii. Posteriormente, la ribozima se reconstituyó in vitro,presentando actividad tanto en presencia de un sustrato natural (pre-ARNtTyr)como de un sustrato bimolecular compuesto por una dupla ARNm-EGS. De estamanera, se generó un sistema de evaluación in vitro de EGSs candidatos para Acinetobacter baumannii, paso previo a la realización de ensayos in vivo sobreesta especie bacteriana.
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Una de estas estrategias de silenciamiento es ladenominada tecnología EGS, que se encuentra mediada por la Ribozima P o ARNasa P, una ribozima presente en todos los dominios y que en bacterias Gramnegativas está conformada por una subunidad ARN-catalítica y por otra proteica. La ARNasa P participa en la maduración de los ARN de transferencia generando elextremo 5´ maduro por un corte simple endonucleolítico de su precursor. Esta propiedad puede emplearse para mediar el corte de una molécula de ARN blanco - cuya expresión quiera ser silenciada- en presencia de un oligorribonucleótido complementario, conocido como External Guide Sequence (EGS).Una vez formado el dúplex ARN blanco : EGS, este complejo puede ser reconocido por la ARNasa Pcomo sustrato y entonces promover el corte endonucleolítico del ARN blanco,inactivándolo. El objetivo global en el que se enmarca este trabajo de tesisconsiste en evaluar estrategias de silenciamiento génico mediante tecnologíaantisentido como posibles antimicrobianos o para prolongar el uso de losantibióticos ya existentes. En este trabajo de tesis doctoral se exploró la posibilidad de inhibir laexpresión de genes bacterianos a través del uso de tecnología EGS antisentido. Inicialmente se trabajó con cepas de Escherichia coli y como blanco se eligió al ARN mensajero del gen ftsZ cuyo producto, la proteína FtsZ es un análogobacteriano de la tubulina y esencial para la división celular. Tanto la expresión deestos pequeños ARNs antisentido dirigidos contra el mensajero ftsZ como laadministración exógena de análogos de ácidos nucleicos no hidrolizables pornucleasas bacterianas, generaron una inhibición de la división celular, originandoun cambio en la morfología de las bacterias y una disminución de la viabilidad delas células tratadas. Estos resultados apoyan la idea que los EGSs dirigidos contragenes vitales bacterianos podrían considerarse como potenciales antimicrobianos. Con la intención de explorar la aplicación de esta tecnología desilenciamiento génico a una especie bacteriana de importancia clínica creciente, selogró identificar, clonar, transcribir y purificar los componentes de la ribozima Pde Acinetobacter baumannii. Posteriormente, la ribozima se reconstituyó in vitro,presentando actividad tanto en presencia de un sustrato natural (pre-ARNtTyr)como de un sustrato bimolecular compuesto por una dupla ARNm-EGS. De estamanera, se generó un sistema de evaluación in vitro de EGSs candidatos para Acinetobacter baumannii, paso previo a la realización de ensayos in vivo sobreesta especie bacteriana. The emergence of infectious diseases caused by multi-resistant bacteriaand the lack of traditional antibiotics for its treatment are a concerning threat forglobal health. Facing the need for development of new antimicrobials, genesilencing through antisense RNAs have been considered as a viable solution. Oneof these antisense strategies is called EGS technology which is mediated byribozyme P or RNase P, a ribozyme present in all domains of life that in Gramnegative bacteria is composed of two subunits: one catalytic – RNA and anotherpeptidic. The RNase P processes pre-transfer RNA, maturating the 5´end by asimple endonucleolitic cut of its precursor. This property can be used to cut anyother target RNA molecule in the presence of a complementaryoligoribonucleotide, known as External Guide Sequence (EGS). Once the duplextarget-RNA: EGS is formed can be recognized by the ribozyme P as a substrate andhence cut the RNA target, leading to its inactivation. The general purpose in whichthis thesis work is immersed consists on the evaluation of different gene silencingstrategies through antisense technology and their use as possible antimicrobialagents or to extend the usage of already existent antibiotics. In this thesis work the possibility of inhibiting bacterial gene expressionthrough EGS antisense technology was explored. Initially, strains of Escherichia coliwere employed and ftsZ mRNA was selected as target. FtsZ protein is a bacterialtubulin analogue essential for cell division. Expression of RNA-EGSs targeting ftsZmRNA as well as exogenous administration of EGSs composed of nucleic acidanalogues non hydrolysable by bacterial nucleases, led to a change in bacterialmorphology and a decrease in cell viability, elicited by an impaired cell division. These results support the idea that EGSs targeting bacterial vital genes could beconsidered as potential antimicrobial agents. Pursuing the intention to apply this gene silencing technology to a bacterialspecies with growing clinical importance, the components of the ribozyme P from Acinetobacter baumannii were identified, cloned, transcribed and purified. Then,the RNase was reconstituted in vitro, showing activity in the presence of a naturalsubstrate such as pre-tRNATyr and also with a bimolecular substrate conformed bymRNA and EGS. Thereby an in vitro evaluation system was generated in order toselect candidate EGSs for Acinetobacter baumannii, previous procedure to in vivoassays. Fil: Davies Sala, Carol G.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2016-03-28 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5940_DaviesSala

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