Desarrollo de alternativas biotecnológicas para la obtención de plantas de Citrus sinensis (L.) Osbeck resistentes a la enfermedad de la Cancrosis de los cítricos

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Entre las enfermedades bacterianas más relevantes para la citricultura argentina se encuentra la Cancrosis de los cítricos, presente en la mayoría de las zonas productoras de todo el mundo, a excepción de Europa. Las pérdidas económicas más importantes son ocasionadas por las restricciones cuarenten...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor principal: Furman, Nicolás
Otros Autores: Mentaberry, Alejandro
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2013
Materias:
CITRICOS TRANSGENICOS
DERMASEPTINA
CANCROSIS
XANTHOMONAS
TRANSGENIC CITRUS
CITRUS CANKER DISEASE
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5346_Furman
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description Entre las enfermedades bacterianas más relevantes para la citricultura argentina se encuentra la Cancrosis de los cítricos, presente en la mayoría de las zonas productoras de todo el mundo, a excepción de Europa. Las pérdidas económicas más importantes son ocasionadas por las restricciones cuarentenarias a los frutos, impuestas por países libres de estas enfermedades, que limitan las exportaciones a tales destinos. Dado que no se ha encontrado resistencia natural a la enfermedad, ni en el germoplasma disponible para el mejoramiento, ni en las especies utilizadas como pie para propagar las variedades comerciales de citrus, actualmente se intenta controlar al patógeno causante de la Cancrosis (Xanthomonas axonopodis pv. citri) mediante la aplicación de bactericidas de contacto a base de cobre. Si bien éstos permiten controlar parcialmente el desarrollo de la enfermedad, no sólo son eliminados por las lluvias y el viento, sino que también resultan contaminantes para el ambiente y para el hombre. Por estas razones el desarrollo de estrategias biotecnológicas representa una alternativa atractiva para la búsqueda de la resistencia a la Cancrosis. En tal sentido, el objetivo principal de esta Tesis fue desarrollar plantas transgénicas de Citrus sinensis (naranjo dulce) resistentes a la enfermedad, a partir de la expresión del péptido antimicrobiano dermaseptina. En primer lugar, se demostró el efecto bactericida del péptido frente a Xanthomonas spp. en ensayos in vitro. Siguiendo estos resultados, se realizó una construcción que permite la expresión constitutiva de dermaseptina y su exportación a apoplasto, región donde se multiplica la bacteria durante la infección. Luego, se transformaron plantas de C. sinensis y se obtuvieron 7 positivas para los genes marcadores de selección utilizados (resistencia kanamicina y GFP), cuya posterior caracterización molecular confirmó la presencia de la secuencia de dermaseptina en el genoma de las plantas. Finalmente, mediante ensayos de infección en cámaras de crecimiento, se estableció que la expresión del péptido antimicrobiano en las plantas transgénicas de naranjo indujo resistencia parcial frente a la infección con X. axonopodis. Si bien aún resta desarrollar ensayos de infección en invernadero, estos resultados permitieron convalidar la estrategia biotecnológica escogida para conferir resistencia a la Cancrosis.
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Dado que no se ha encontrado resistencia natural a la enfermedad, ni en el germoplasma disponible para el mejoramiento, ni en las especies utilizadas como pie para propagar las variedades comerciales de citrus, actualmente se intenta controlar al patógeno causante de la Cancrosis (Xanthomonas axonopodis pv. citri) mediante la aplicación de bactericidas de contacto a base de cobre. Si bien éstos permiten controlar parcialmente el desarrollo de la enfermedad, no sólo son eliminados por las lluvias y el viento, sino que también resultan contaminantes para el ambiente y para el hombre. Por estas razones el desarrollo de estrategias biotecnológicas representa una alternativa atractiva para la búsqueda de la resistencia a la Cancrosis. En tal sentido, el objetivo principal de esta Tesis fue desarrollar plantas transgénicas de Citrus sinensis (naranjo dulce) resistentes a la enfermedad, a partir de la expresión del péptido antimicrobiano dermaseptina. En primer lugar, se demostró el efecto bactericida del péptido frente a Xanthomonas spp. en ensayos in vitro. Siguiendo estos resultados, se realizó una construcción que permite la expresión constitutiva de dermaseptina y su exportación a apoplasto, región donde se multiplica la bacteria durante la infección. Luego, se transformaron plantas de C. sinensis y se obtuvieron 7 positivas para los genes marcadores de selección utilizados (resistencia kanamicina y GFP), cuya posterior caracterización molecular confirmó la presencia de la secuencia de dermaseptina en el genoma de las plantas. Finalmente, mediante ensayos de infección en cámaras de crecimiento, se estableció que la expresión del péptido antimicrobiano en las plantas transgénicas de naranjo indujo resistencia parcial frente a la infección con X. axonopodis. Si bien aún resta desarrollar ensayos de infección en invernadero, estos resultados permitieron convalidar la estrategia biotecnológica escogida para conferir resistencia a la Cancrosis. Canker disease is one of the most important bacterial diseases affecting citric production in Argentina, and it is also present in most producing areas around the world, except in Europe. Since that a substantial percentage of lemon, grapefruit and orange is intended for export, outbreaks of this disease provoke an immediate quarantine for the fruits harvested in the affected areas, with the subsequent losses of economic income. As no natural resistance has been found, neither in commercial orange varieties nor in any of the common graft stock varieties, current attempts to control the Canker causative pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri consists of preventive sprayings with copper-based bactericides. Despite this approach confers partial disease control, copper-based bactericides are not only be eliminated by rain and wind, but they also result harmful to the environment and to human beings. Due to these limitations, biotechnological strategies represent an attractive alternative for the search of Canker resistance. In that way, the main aim of this work was to obtain transgenic Citrus sinensis (sweet orange) plants expressing an antimicrobial peptide (dermaseptin) in order to confer resistance against Xanthomonas axonopodis pv. citri infections. First of all, bactericidal effect of dermaseptin against Xanthomonas spp. was demonstrated by in vitro assays. Following these results, a genetic construct allowing the constitutive expression of dermaseptin and its export to apoplast was generated. That´s where bacteria multiplies during infection. Then, C. sinensis plants where transformed with this construction, obtaining seven positive plants for the GFP and kanamycin marker genes. Later molecular characterization confirmed the presence of dermaseptin sequence in the corresponding genomes. Finally, controlled X. axonopodis infection assays showed significant reduction of disease symptoms in transgenic plants. Even though the results obtained in this work should be confirmed at the level of greenhouse and field trial assays (since controlled infection assays cannot be directly extrapolated to real agricultural conditions), they indicate that the strategy used in this work could be effective in achieving Canker resistance. Fil: Furman, Nicolás. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2013 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5346_Furman

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