Estrategia de reprogramación traduccional del virus Junín en infecciones in vitro : estudio de las principales vías de regulación del inicio de la traducción

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Dentro de los factores que determinan el éxito de una infección viral la eficiencia en latraducción de las proteínas del virus constituye un factor clave a la hora de definir tanto lacitopatogenicidad como la virulencia de estos agentes. Los virus son parásitos intracelularesobligados, por lo cual d...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Linero, Florencia N.
Otros Autores: Scolaro, Luis Alberto
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2011
Materias:
VIRUS JUNIN
NUCLEOPROTEINA
TRADUCCION
ELF4E
ELF4A
ELF4G
ELF2
GRANULOS DE ESTRES
JUNIN VIRUS
NUCLEOPROTEIN
TRANSLATION
STRESS GRANULES
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4956_Linero
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description Dentro de los factores que determinan el éxito de una infección viral la eficiencia en latraducción de las proteínas del virus constituye un factor clave a la hora de definir tanto lacitopatogenicidad como la virulencia de estos agentes. Los virus son parásitos intracelularesobligados, por lo cual dependen completamente de la maquinaria traduccional de la célulahospedadora para sintetizar sus proteínas. Esta dependencia los ha llevado a desarrollar distintasestrategias de reprogramación traduccional a fin de asegurar la competencia efectiva de sus mARNscon los mARNs celulares por la maquinaria de traducción. En este trabajo de tesis doctoral se analizóla estrategia de reprogramación traduccional utilizada por el virus Junín (JUNV) para lograr latraducción de sus mARNs. El estudio se centró fundamentalmente en el proceso de inicio de latraducción, evaluándose la participación del complejo eIF (eIF4E, eIF4A y eIF4GI) y del factor eIF2 y lamodulación de sus principales mecanismos de regulación. En este trabajo se demostró que JUNV es capaz de traducir las proteínas virales aún enausencia del factor de unión al cap, eIF4E, a pesar de que sus mRNAs presentan dichas estructuras ensus extremos 5´. Esto fue comprobado mediante el empleo de inhibidores de la vía de PI3K/Akt/mTOR, principal vía regulatoria de la traducción dependiente del cap, observándose que lainhibición de PI3K posterior a la entrada del virus no tuvo efectos significativos en la replicación de JUNV. Estos resultados fueron corroborados mediante el tratamiento con la droga rapamicina, uninhibidor del complejo mTOR/raptor, la cual no afectó la síntesis de antígenos virales. La expresión deuna proteína dominante negativa de 4E-BP, proteína reguladora de eIF4E, tampoco afectó lareplicación de JUNV, reforzando la idea de que el factor eIF4E no sería necesario en la replicación de JUNV. Asimismo, la inhibición de la vía de PI3K/Akt en un cultivo persistentemente infectado con JUNV tampoco afectó la síntesis de los antígenos virales. Por otro lado, se demostró un bloqueo en la fosforilación de eIF2α ejercido por JUNV. Lafosforilación de este factor constituye uno de los principales mecanismos de la respuesta celularantiviral, mediante el cual la célula induce el bloqueo global de la traducción con el fin de impedir lareplicación viral. La consecuencia de esta fosforilación es el secuestro de los factores de inicio de latraducción en estructuras citoplasmáticas denominadas gránulos de estrés (SGs). Los resultadosobtenidos demostraron que el bloqueo en la fosforilación de eIF2α inducido por JUNV inhibe laformación de SGs cuando las células infectadas son tratadas con un inductor de estrés oxidativo. Esteimpedimento sería mediado fundamentalmente por la expresión de los antígenos virales N y GPC y tendría por finalidad mantener activo al factor eIF2 como así también asegurar el acceso a losfactores de inicio de la traducción, que de otra manera podrían quedar secuestrados en los SGs. Estamodulación de la respuesta a la estrés celular no fue observada en los cultivos persistentementeinfectados con JUNV, indicando que la ausencia de expresión de G1 y probablemente los bajos nivelesde la proteína N en su forma completa serían responsables de que estos cultivos persistentementeinfectados no logren bloquear la respuesta celular al estrés. Por otro lado, se demostró el requerimiento de los factores de inicio de la traducción delcomplejo eIF: eIF4A y eIF4G, mediante ensayos de silenciamiento y el empleo de inhibidoresespecíficos, indicando una estrategia de traducción alternativa en la cual la participación de eIF4E,integrante canónico de dicho complejo, no sería requerida. Probablemente la participación de unaproteína viral en reemplazo del factor de unión al cap eIF4E, favorecería la traducción de los mARNsde JUNV, sin inducir un bloqueo en la síntesis de las proteínas celulares. La interacción de N con losfactores eIF4A y eIF4GI, evaluada mediante ensayos de inmunoprecipitación y microscopía confocal,sugiere que esta proteína viral estaría formando parte de los complejos de traducción de los mARNsvirales. En función de los resultados expuestos se plantea un modelo de reprogramación traduccionalpara JUNV en el cual el factor de unión al cap, eIF4E, no sería mayoritariamente requerido para latraducción de los antígenos virales. La actividad de este factor sería reemplazada por la proteína Nque mediante su interacción con los factores eIF4A y eIF4GI constituiría los complejos de traduccióndel virus. Sin embargo, no puede descartarse la participación de eIF4E en la traducción inicial de losmARNs de N, hasta que los niveles de esta proteína puedan competir efectivamente con dicho factor.
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spelling tesis:tesis_n4956_Linero2023-10-02T20:02:49Z Estrategia de reprogramación traduccional del virus Junín en infecciones in vitro : estudio de las principales vías de regulación del inicio de la traducción Junin virus translational reprogramming strategy: study of the main regulation pathways during initiation of translation Linero, Florencia N. Scolaro, Luis Alberto VIRUS JUNIN NUCLEOPROTEINA TRADUCCION ELF4E ELF4A ELF4G ELF2 GRANULOS DE ESTRES JUNIN VIRUS NUCLEOPROTEIN TRANSLATION ELF4E ELF4A ELF4G ELF2 STRESS GRANULES Dentro de los factores que determinan el éxito de una infección viral la eficiencia en latraducción de las proteínas del virus constituye un factor clave a la hora de definir tanto lacitopatogenicidad como la virulencia de estos agentes. Los virus son parásitos intracelularesobligados, por lo cual dependen completamente de la maquinaria traduccional de la célulahospedadora para sintetizar sus proteínas. Esta dependencia los ha llevado a desarrollar distintasestrategias de reprogramación traduccional a fin de asegurar la competencia efectiva de sus mARNscon los mARNs celulares por la maquinaria de traducción. En este trabajo de tesis doctoral se analizóla estrategia de reprogramación traduccional utilizada por el virus Junín (JUNV) para lograr latraducción de sus mARNs. El estudio se centró fundamentalmente en el proceso de inicio de latraducción, evaluándose la participación del complejo eIF (eIF4E, eIF4A y eIF4GI) y del factor eIF2 y lamodulación de sus principales mecanismos de regulación. En este trabajo se demostró que JUNV es capaz de traducir las proteínas virales aún enausencia del factor de unión al cap, eIF4E, a pesar de que sus mRNAs presentan dichas estructuras ensus extremos 5´. Esto fue comprobado mediante el empleo de inhibidores de la vía de PI3K/Akt/mTOR, principal vía regulatoria de la traducción dependiente del cap, observándose que lainhibición de PI3K posterior a la entrada del virus no tuvo efectos significativos en la replicación de JUNV. Estos resultados fueron corroborados mediante el tratamiento con la droga rapamicina, uninhibidor del complejo mTOR/raptor, la cual no afectó la síntesis de antígenos virales. La expresión deuna proteína dominante negativa de 4E-BP, proteína reguladora de eIF4E, tampoco afectó lareplicación de JUNV, reforzando la idea de que el factor eIF4E no sería necesario en la replicación de JUNV. Asimismo, la inhibición de la vía de PI3K/Akt en un cultivo persistentemente infectado con JUNV tampoco afectó la síntesis de los antígenos virales. Por otro lado, se demostró un bloqueo en la fosforilación de eIF2α ejercido por JUNV. Lafosforilación de este factor constituye uno de los principales mecanismos de la respuesta celularantiviral, mediante el cual la célula induce el bloqueo global de la traducción con el fin de impedir lareplicación viral. La consecuencia de esta fosforilación es el secuestro de los factores de inicio de latraducción en estructuras citoplasmáticas denominadas gránulos de estrés (SGs). Los resultadosobtenidos demostraron que el bloqueo en la fosforilación de eIF2α inducido por JUNV inhibe laformación de SGs cuando las células infectadas son tratadas con un inductor de estrés oxidativo. Esteimpedimento sería mediado fundamentalmente por la expresión de los antígenos virales N y GPC y tendría por finalidad mantener activo al factor eIF2 como así también asegurar el acceso a losfactores de inicio de la traducción, que de otra manera podrían quedar secuestrados en los SGs. Estamodulación de la respuesta a la estrés celular no fue observada en los cultivos persistentementeinfectados con JUNV, indicando que la ausencia de expresión de G1 y probablemente los bajos nivelesde la proteína N en su forma completa serían responsables de que estos cultivos persistentementeinfectados no logren bloquear la respuesta celular al estrés. Por otro lado, se demostró el requerimiento de los factores de inicio de la traducción delcomplejo eIF: eIF4A y eIF4G, mediante ensayos de silenciamiento y el empleo de inhibidoresespecíficos, indicando una estrategia de traducción alternativa en la cual la participación de eIF4E,integrante canónico de dicho complejo, no sería requerida. Probablemente la participación de unaproteína viral en reemplazo del factor de unión al cap eIF4E, favorecería la traducción de los mARNsde JUNV, sin inducir un bloqueo en la síntesis de las proteínas celulares. La interacción de N con losfactores eIF4A y eIF4GI, evaluada mediante ensayos de inmunoprecipitación y microscopía confocal,sugiere que esta proteína viral estaría formando parte de los complejos de traducción de los mARNsvirales. En función de los resultados expuestos se plantea un modelo de reprogramación traduccionalpara JUNV en el cual el factor de unión al cap, eIF4E, no sería mayoritariamente requerido para latraducción de los antígenos virales. La actividad de este factor sería reemplazada por la proteína Nque mediante su interacción con los factores eIF4A y eIF4GI constituiría los complejos de traduccióndel virus. Sin embargo, no puede descartarse la participación de eIF4E en la traducción inicial de losmARNs de N, hasta que los niveles de esta proteína puedan competir efectivamente con dicho factor. Translation efficiency of viral proteins is a key factor in defining both cytopathogenicity andvirulence of viruses, which are obligate intracellular parasites and entirely dependent on the cellulartranslational machinery to synthesize their proteins. This dependence has led them to developdifferent strategies of translational reprogramming to ensure effective competition of viral mRNAswith cellular mRNAs. In this doctoral thesis the translational reprogramming strategy used by Juninvirus (JUNV) to achieve the translation of its mRNAs, was analyzed. The study was focused primarilyon the process of translation initiation, to evaluate the involvement of eIF complex (eIF4E, eIF4A andeIF4GI) and the eIF2 factor and the modulation of main regulatory mechanisms. Results suggest that JUNV might be able to translate viral proteins even in the absence of thecap-binding factor, eIF4E, although its mRNAs have cap structures in their 5 'ends. This is supportedby the fact that inhibitors of PI3K/Akt/mTOR pathway, the main regulatory pathway of capdependenttranslation were effective only during virus entry but not on JUNV protein translation. Treatment of infected cells with rapamycin, an mTOR complex/raptor inhibitor and the expression ofa dominant negative protein 4E-BP, eIF4E regulatory protein, had no effect on JUNV replication,reinforcing the idea that the eIF4E factor would not be required for JUNV replication. Furthermore,inhibition of PI3K/Akt pathway in a JUNV persistently infected culture did not affect the synthesis ofviral antigens. On the other hand, a blockage on the eIF2α phosphorylation exerted by JUNV was observed. Phosphorylation of this factor is one of the main mechanisms of the antiviral cellular response, bywhich cell induces a global translation blockade to prevent viral replication. The consequence of thisphosphorylation is the sequestering of the initiation translation factors in cytoplasmic structuresnamed stress granules (SGs). The results showed that blockage in the phosphorylation of eIF2αinduced by JUNV inhibits the formation of SGs when infected cells are treated with an oxidative stressinductor. This blockage would be mediated primarily by the expression of viral antigens N and GPCand would aim to keep eIF2 factor active to ensure virus access to initiation translation factors whichmight otherwise be sequestered into SGs. This modulation on the cellular stress response was notobserved in cultures persistently infected with JUNV, indicating that the absence of expression of G1and probably low levels of the complete form of N protein would be responsible for these persistentlyinfected cultures inability to block the cellular stress response. Requirement of initiation translation complex eIF: eIF4A and eIF4G has been assessed by ARNinterfering assays and the use of specific inhibitors. Results indicate an alternative translation strategyin which the involvement of eIF4E, a canon member of this complex would not be required. Probably,the involvement of a viral protein to replace the cap binding factor eIF4E, would favor the translationof JUNV mRNAs without inducing a blockage in cellular proteins synthesis. N interaction with eIF4Aand eIF4GI factors was assessed by immunoprecipitation assays and confocal microscopy suggestingthat this viral protein would be part of the translation complex of viral mRNAs. Based on the above results a model for JUNV translational reprogramming is presented. Inthis model, the cap-binding factor, eIF4E, would be replaced by N protein through its interaction witheIF4A and eIF4GI factors constituting the translation complex for viral proteins. However, it cannot beruled out the involvement of eIF4E at the initial translation step of N mRNA, until the level of thisprotein can be high enough to compete effectively with this factor. Fil: Linero, Florencia N.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2011 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4956_Linero

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