Células dendríticas en la inmunoterapia del cáncer : desarrollo de una vacuna anti-melanoma en un modelo experimental

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La incidencia del melanoma aumenta a mayor velocidad que la de otros cánceres y lasobrevida de pacientes con metástasis distantes es generalmente < l año. Con el avance en lacomprensión de los requerimientos para inducir inmunidad las CD se han convertido enatractivos vectores para la inmunoterap...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Goldszmid, Silvana Romina
Otros Autores:	Wainstok, Rosa
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2003
Materias:	CELULAS DENDRITICAS MELANOMA INMUNOTERAPIA CANCER VACUNAS APOPTOSIS DENDRITIC CELLS MELANOMA IMMUNOTHERAPY VACCINES
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3699_Goldszmid
Aporte de:	Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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El objetivo del presente trabajo de Tesis fue estudiar desarrollar una vacuna anti-melanomautilizando CD cargadas con células tumorales apoptóticas y estudiar los mecanismosinvolucrados en la respuesta inducida contra el tumor. Para ello, se utilizó el modelo demelanoma murino B16. El melanoma B16 es un tumor de origen espontáneo, débilmenteinmunogénico y por lo tanto provee un marco adecuado para el estudio de la modulación de larespuesta inmune anti-tumoral. Las CD aisladas a partir de precursores de médula ósea fueron cultivadas en presencia desobrenadante de cultivo de la línea productora de GM-CSF establecida mostraron un fenotipoinmaduro con baja expresión de moléculas MHC I y II y coestimulatorias y alta capacidad decaptación antigénica tanto por fagocitosis de Ag particulados como endocitosis demacromoléculas. Luego de inducir la maduración con LPS se observó un marcado aumento en laexpresión de moléculas MHC I y II y coestimulatorias y un aumento en la capacidadestimulatoria en cultivos mixtos alogeneicos. Ensayos de migración in vitro mostraron la altacapacidad migratoria de las CD inmaduras en respuesta a estímulos inflamatorios y de CDmaduras en respuesta a quimioquinas constitutivamente secretadas en los ganglios linfáticos. Secomprobó también, mediante la realización de ensayos de migración in vivo, que las CDinyectadas subcutáneamente eran capaces de migrar hacia los ganglios linfáticos de drenaje. Estos resultados reflejaron el potencial de las CD obtenidas para su utilización en el diseño deuna vacuna anti-tumoral. La apoptosis de las células B16 fue inducida por radiación y y evidenciada por tinción con Anexina V / IP. 48 hs después de la irradiación se observaron 70 —80 % de células apoptóticascaracterizadas por la tinción Anexina +/ IP - comparadas con lO—12 % en las células sin tratar. Las células Bl6 apoptóticas fueron eficientemente fagocitadas por CD inmaduras. Luego de 24hs de cocultivo gran proporción (> 50 %) de CD había incorporado material apoptótico según seevidenció por FACS, microscopía confocal y microscopía electrónica. El cocultivo con células tumorales apoptóticas indujo la maduración de las CD, evidenciada porun aumento en la expresión de MHC II y CD86 respecto a CD inmaduras cultivadas en ausenciade células apoptóticas. Dicho aumento se observo principalmente en la población de CD quehabía incorporado material apoptótico. Otra evidencia de la maduración de las CD, fue lamarcada disminución de la capacidad endocítica con respecto a CD inmaduras (intensidad defluorescencia media 35,8 vs. 192,5). Luego de ser inyectadas subcutáneamente, CD cocultivadascon células apoptóticas o CD solas migraron hacia los ganglios linfáticos en forma comparable. Las CD encontradas en los ganglios correspondían a ~0.5% del inoculo original y en ambos casosse observo una expresión uniforme de MHC II y CD86 equivalente a la observada en CDmaduras. La vacunación con CD cargadas con células tumorales apoptóticas (CD-Apo) indujo un alto nivelde protección contra el desarrollo del melanoma B16: 80 % de los animales permanecieron libresde tumor 12 semanas después del desafió. Dicha protección fue especifica para el melanoma B16,ya que todos los animales vacunados desarrollaron tumor cuando fueron desafiados con un tumorsingeneico no relacionado. 80 % de los animales vacunados con CD-Apo y desafiados 10 semanas después de lainmunización permanecieron libres de tumor, consistente con la inducción de memoriainmunológica. Estudios de depleción in vivo de subpoblaciones linfocitarias demostraron que tantolinfocitos T CD4+ como CD8+ son son necesarios para la efectiva vacunación con CD-Apo. Seevidenció que ambas poblaciones linfocitarias son activadas para la producción de IFNy cuandoson estimuladas con CD-Apo y CD-TRP-2. Además, los linfocitos CD8+ son capaces dereconocer células Bl6 intactas in vitro y de lisar células pulsadas con TRP-2 in vivo. El estudio de la inmunidad humoral demostró la presencia de anticuerpos específicosdirigidos contra las ce'lulas B16. Por último, en el análisis del sitio de inyección del tumor seobservó un importante infiltrado de neutrófilos a tiempos muy tempranos, siendo máximo seisdías después de la inyección del tumor. La presencia de linfocitos en el sitio de inyección seobservó más tardíamente. Esto podría indicar que los neutrófilos también juegan un rolimportante en el rechazo tumoral. En el presente trabajo de Tesis se ha demostrado por primera vez, que la vacunación con CD cargadas con células tumorales apoptóticas (CD-Apo) induce inmunidad a largo plazodependiente de la acción combinada de linfocitos T CD4+ y CD8+ contra el melanoma B16débilmente inmunogénico. Este modelo preclínico provee el marco necesario para la realizaciónde estudios clínicos comparables utilizando CD-Apo como adyuvante para la inmunización activacontra el cáncer.
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Consideradas las más potentes célulaspresentadoras de Ag (APC), las células dendríticas (CD) actúan como centinelas del sistemainmune, patrullando a través de la sangre, tejidos periféricos, linfa y órganos linfoidessecundarios alertando al sistema inmune y controlando sus decisiones más tempranas. En laperiferia las CD inmaduras capturan antígenos (Ag) y migran hacia los órganos linfoidessecundarios donde presentan dichos Ag a linfocitos T naïve induciendo la activación de larespuesta inmune. El objetivo del presente trabajo de Tesis fue estudiar desarrollar una vacuna anti-melanomautilizando CD cargadas con células tumorales apoptóticas y estudiar los mecanismosinvolucrados en la respuesta inducida contra el tumor. Para ello, se utilizó el modelo demelanoma murino B16. El melanoma B16 es un tumor de origen espontáneo, débilmenteinmunogénico y por lo tanto provee un marco adecuado para el estudio de la modulación de larespuesta inmune anti-tumoral. Las CD aisladas a partir de precursores de médula ósea fueron cultivadas en presencia desobrenadante de cultivo de la línea productora de GM-CSF establecida mostraron un fenotipoinmaduro con baja expresión de moléculas MHC I y II y coestimulatorias y alta capacidad decaptación antigénica tanto por fagocitosis de Ag particulados como endocitosis demacromoléculas. Luego de inducir la maduración con LPS se observó un marcado aumento en laexpresión de moléculas MHC I y II y coestimulatorias y un aumento en la capacidadestimulatoria en cultivos mixtos alogeneicos. Ensayos de migración in vitro mostraron la altacapacidad migratoria de las CD inmaduras en respuesta a estímulos inflamatorios y de CDmaduras en respuesta a quimioquinas constitutivamente secretadas en los ganglios linfáticos. Secomprobó también, mediante la realización de ensayos de migración in vivo, que las CDinyectadas subcutáneamente eran capaces de migrar hacia los ganglios linfáticos de drenaje. Estos resultados reflejaron el potencial de las CD obtenidas para su utilización en el diseño deuna vacuna anti-tumoral. La apoptosis de las células B16 fue inducida por radiación y y evidenciada por tinción con Anexina V / IP. 48 hs después de la irradiación se observaron 70 —80 % de células apoptóticascaracterizadas por la tinción Anexina +/ IP - comparadas con lO—12 % en las células sin tratar. Las células Bl6 apoptóticas fueron eficientemente fagocitadas por CD inmaduras. Luego de 24hs de cocultivo gran proporción (> 50 %) de CD había incorporado material apoptótico según seevidenció por FACS, microscopía confocal y microscopía electrónica. El cocultivo con células tumorales apoptóticas indujo la maduración de las CD, evidenciada porun aumento en la expresión de MHC II y CD86 respecto a CD inmaduras cultivadas en ausenciade células apoptóticas. Dicho aumento se observo principalmente en la población de CD quehabía incorporado material apoptótico. Otra evidencia de la maduración de las CD, fue lamarcada disminución de la capacidad endocítica con respecto a CD inmaduras (intensidad defluorescencia media 35,8 vs. 192,5). Luego de ser inyectadas subcutáneamente, CD cocultivadascon células apoptóticas o CD solas migraron hacia los ganglios linfáticos en forma comparable. Las CD encontradas en los ganglios correspondían a ~0.5% del inoculo original y en ambos casosse observo una expresión uniforme de MHC II y CD86 equivalente a la observada en CDmaduras. La vacunación con CD cargadas con células tumorales apoptóticas (CD-Apo) indujo un alto nivelde protección contra el desarrollo del melanoma B16: 80 % de los animales permanecieron libresde tumor 12 semanas después del desafió. Dicha protección fue especifica para el melanoma B16,ya que todos los animales vacunados desarrollaron tumor cuando fueron desafiados con un tumorsingeneico no relacionado. 80 % de los animales vacunados con CD-Apo y desafiados 10 semanas después de lainmunización permanecieron libres de tumor, consistente con la inducción de memoriainmunológica. Estudios de depleción in vivo de subpoblaciones linfocitarias demostraron que tantolinfocitos T CD4+ como CD8+ son son necesarios para la efectiva vacunación con CD-Apo. Seevidenció que ambas poblaciones linfocitarias son activadas para la producción de IFNy cuandoson estimuladas con CD-Apo y CD-TRP-2. Además, los linfocitos CD8+ son capaces dereconocer células Bl6 intactas in vitro y de lisar células pulsadas con TRP-2 in vivo. El estudio de la inmunidad humoral demostró la presencia de anticuerpos específicosdirigidos contra las ce'lulas B16. Por último, en el análisis del sitio de inyección del tumor seobservó un importante infiltrado de neutrófilos a tiempos muy tempranos, siendo máximo seisdías después de la inyección del tumor. La presencia de linfocitos en el sitio de inyección seobservó más tardíamente. Esto podría indicar que los neutrófilos también juegan un rolimportante en el rechazo tumoral. En el presente trabajo de Tesis se ha demostrado por primera vez, que la vacunación con CD cargadas con células tumorales apoptóticas (CD-Apo) induce inmunidad a largo plazodependiente de la acción combinada de linfocitos T CD4+ y CD8+ contra el melanoma B16débilmente inmunogénico. Este modelo preclínico provee el marco necesario para la realizaciónde estudios clínicos comparables utilizando CD-Apo como adyuvante para la inmunización activacontra el cáncer. Melanoma is the cancer with the fastest increasing incidence, and survival of patients withdistant metastases is generally < l year. With increased understanding of the requirements forinitiating immunity, dendritic cells (DCs) have become attractive vectors for immunotherapy ofthis and other cancers. Considered the most potent antigen presenting cells (APC), DC act assentinels of the immune system, they patrol trough the blood, periphery, lymph and lymphoidorgans, alerting the immune system and controlling its early decisions. At the periphery immature DC capture antigens (Ag) and migrate to the secondary lymphoid organs where they presentthose Ag to naïve T cells and therefore inducing the immune response. The aim of this Thesis work was to develop an anti-melanoma vaccine using DC loadedwith apoptotic tumor cells and to study the mechanisms underlying the induced anti-tumorresponse. In order to do that, we used the B16 melanoma. The B16 melanoma is a poorlyimmunogenic tumor of spontaneous origin, thus providing the adequate background to exploremaneuvers to increase host defenses against it. The DC obtained from bone marrow precursors were cultured in the presence of GM-CSFcontaining supematant from the previously established GM-CSF producing cell line, showed animmature phenotype with low expression of MHC II and I and co-stimulatory molecules and high Ag capture capacity. After LPS induced maturation DC showed an up-regulated expression of MHC I and II and co-stimulatory molecules and high T cell activation capacity in the mixedleukocyte reaction. DC also showed a high migratory activity as evidenced by in vitro migrationassays. Furthermore, it has also been shown that after s.c. injection DC migrated to the draininglymph nodes. These observations pointed out the potential of DC for the design of anti- tumorvaccines. To induce apoptosis, B16 cells were irradiated (70 Gy) and cultured for 48 h. Apoptosiswas documented by AnexinV / PI staining. After 48 h, cultured unirradiated cells contained 10-12%early apoptotic cells characterized by AnnexinV + / PI —staining. In contrast, 70-80% ofirradiated cultured tumor cells had undergone early apoptotic death. 12-19% of the cellsdisplayed AnnexinV + / PI + staining, indicating secondary necrosis in both unirradiated andirradiated cultures. Then DCs were cultured apoptotic tumor cells for 24h. At 37°C, over 50% ofimmature DCs phagocytosed apoptotic material, as confirmed by FACS, confocal fluorescencemicroscopy and electron microscopy. After coculture a large fraction of the tumor-exposed DCs upregulated CD86 as well as MHC II. Another evidence of the induced maturation was the down-regulated capacity toendocytose FITC-Dextran as compared with immature DC(mean fluorescence 35,8 vs 192, 5). Following injection, DCs migrated to the draining lymph nodes comparably to control DCs at alevel corresponding to ~0.5% of the injected inoculum and uniformly expressed high levels of CD86 and MHC II molecules comparable to fully mature and immunogenic DC. Mice vaccinated with tumor-loaded DCs (DC-Apo) showed a strong protection against anintracutaneous challenge with B16: 80% of the mice remaining tumor-free 12 weeks afterchallenge. This protection was not observed when vaccinated mice were challenged with a nonrelatedsyngeneic tumor. 80 % of mice receiving a tumor challenge 10 weeks after vaccination were also protected,consistent with the induction of tumor-specific memory. When either CD4+ or CD8+ T cells were depleted in vivo at the time of challenge, theprotection was completely abrogated, indicating that both CD4+ and CD8+ T cells are necessaryfor the effective anti-tumor response induced DC-Apo vaccination. CD4+ and CD8+ T cells were efficiently primed in vaccinated animals, as evidenced byinterferon-y secretion after in vitro stimulation with DC-Apo or DCs pulsed with TRP-2. Inaddition, B16 melanoma cells were recognized by immune CD8+ T cells in vitro, and cytolyticactivity against TRP-2(180-188) pulsed target cells was observed in vivo. The study of the humoral response showed the presence of anti-B16 specific antibodies. Finally, when the tumor injection site was analyzed a large amount of neutrophils were observedat very early time points and being maximum six days following tumor challenge. The presenceof lymphocytes at the injection site was observed only at later time points. This could indicate thaneutrophils also play an important role in the tumor rejection. In the present Thesis work it has been shown for the first time, that DCs phagocytosingapoptotic tumor cells (DC-Apo) elicit long-lived combined CD4+ and CD8+ immunity against thepoorly immunogenic B16 melanoma. This preclinical model sets the stage for comparable studiesin humans with DC-Apo as adjuvants for active immunization against cancer. Fil: Goldszmid, Silvana Romina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2003 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3699_Goldszmid

Células dendríticas en la inmunoterapia del cáncer : desarrollo de una vacuna anti-melanoma en un modelo experimental

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