La estabilidad térmica de la bomba de calcio de membrana plasmática
El estudio estructural y funcional de las proteínas de membrana se ve dificultadopor la gran complejidad de los sistemas en las cuales éstas se hallan insertas, y porque, engeneral, estas proteínas se inactivan espontáneamente. La estructura tridimensional de una proteína está determinada por la int...
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| Formato: | Tesis doctoral publishedVersion |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
2001
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| Materias: | |
| Acceso en línea: | https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3348_Levi |
| Aporte de: |
| Sumario: | El estudio estructural y funcional de las proteínas de membrana se ve dificultadopor la gran complejidad de los sistemas en las cuales éstas se hallan insertas, y porque, engeneral, estas proteínas se inactivan espontáneamente. La estructura tridimensional de una proteína está determinada por la interacciónentre los grupos que componen la cadena polipeptídica, y entre estos grupos y el medio enel cual se halla inserta. Estas fuerzas intra e intermoleculares también definen suestabilidad. Además, para que una proteína cumpla su función biológica, se requiere queconserve su estructura nativa. Estas observaciones muestran una estrecha relación entre laestructura, la estabilidad y la función de las proteínas, y sugieren que se pueden evaluarcaracterísticas estructurales y funcionales de las mismas a partir del estudio de suestabilidad. Este enfoque fue empleado en el estudio de la bomba de calcio de membranaplasmática (PMCA), una proteína integral de membrana, de Mr 134000, responsable deltransporte de Ca2+ hacia el exterior de células eucariotas. La energía requerida para estafunción proviene directamente de la hidrólisis del ATP. En una primera etapa, determinamos que la pérdida espontánea de la actividad Ca2+-ATPasa de la bomba de calcio purificada y reconstituida en micelas de fosfolípidosy detergente, sería consecuencia de la desnaturalización de la proteína. La inactivaciónsiguió una cinética de pseudo-primer orden, que estaria asociada a una transición entredos estados y ocurriría a través de un único mecanismo en el intervalo 33-45 °C. Dadoque el proceso es irreversible, el coeficiente cinético de la inactivación es inversamenteproporcional a la estabilidad de la enzima. Una vez caracterizado este proceso, estudiamos los cambios en la disposiciónestructural de la enzima durante la desnaturalización térmica. Para ello empleamos unanálisis combinado que incluyó el análisis de la fluorescencia de un conjunto de sondasespecíficas y ensayos de actividad enzimática. Establecimos que el dominio de unión acalmodulina se desnaturaliza antes que el dominio catalítico, en tanto que el dominiotransmembránico permanece plegado durante la desnaturalización térmica. Como la función vinculada a los distintos dominios es afectada por ligandosespecíficos de la enzima, exploramos el efecto de éstos en la estabilidad. Determinamosque Ca2+, calmodulina y un análogo no hidrolizable del ATP estabilizan al dominiocatalítico. Exploramos además el efecto de un ligando cuya relevancia sobre la estructuray función de la bomba no ha sido determinada, i.e., la propia bomba de calcio. Ladimerización fue caracterizada empleando la transferencia de energía entre la bomba decalcio marcada con la sonda fluorescente FITC y la marcada con EITC. El mecanismo molecular de la dimerización fue estudiado determinando laeficiencia de la transferencia de energía entre FITC-PMCA y EITC-PMCA luego dedesplegar distintas regiones de la enzima. Estos ensayos permitieron definir que ladimerización involucra la interacción entre el dominio de unión a calmodulina y dossegmentos de la bomba a las cuales se une el péptido C28W cuya secuencia se encuentraincluida en la del mencionado dominio. La relevancia biológica del proceso de dimerización fue estudiada determinando ladependencia de la estabilidad de la bomba de calcio con su concentración. El análisisteórico de los resultados obtenidos permitió determinar que la estabilidad de la bomba decalcio dimérica es 200 veces mayor que la monomérica. La estructura y función de las proteínas de membrana se encuentran íntimamenterelacionadas con los sistemas micelares en el cual se hallan insertas. Por este motivo,exploramos la dependencia de la estabilidad de la bomba purificada con la composiciónde las micelas. Basándose en los resultados obtenidos en tres sistemas micelaresdiferentes, postulamos un modelo que propone que la estabilidad de la enzima aumenta amedida que la monocapa de anfifilos que recubre la superficie hidrofóbica del dominiotransmembránico se enriquece en fosfolípidos. La composición de la monocapa estárelacionada con la afinidad de los fosfolípidos respecto a la del detergente por estasuperficie (KLD). Desarrollamos un método que permite determinar KLD utilizandotransferencia de energía entre los residuos triptofano de la PMCA y un fosfolípidomarcado con pireno. Los valores de KLD obtenidos por este procedimiento sonconsistentes con los determinados a partir del modelo. En conclusión, los resultados obtenidos en este trabajo de tesis sugieren que elestudio de la estabilidad de proteínas podría constituir una metodología general de granutilidad para explorar aspectos estructurales y funcionales de una amplia gama deproteínas. |
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