La estabilidad térmica de la bomba de calcio de membrana plasmática

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El estudio estructural y funcional de las proteínas de membrana se ve dificultadopor la gran complejidad de los sistemas en las cuales éstas se hallan insertas, y porque, engeneral, estas proteínas se inactivan espontáneamente. La estructura tridimensional de una proteína está determinada por la int...

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Autor principal: Levi, Valeria
Otros Autores: Rossi, Juan Pablo F. C.
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2001
Materias:
PROTEINA DE MEMBRANA
ESTABILIDAD ESTRUCTURAL
BOMBA DE CALCIO
ATPASA
DESNATURALIZACION TERMICA
MEMBRANE PROTEIN
STRUCTURAL STABILITY
CALCIUM PUMP
ATPASE
THERMAL DENATURATION
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3348_Levi
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description El estudio estructural y funcional de las proteínas de membrana se ve dificultadopor la gran complejidad de los sistemas en las cuales éstas se hallan insertas, y porque, engeneral, estas proteínas se inactivan espontáneamente. La estructura tridimensional de una proteína está determinada por la interacciónentre los grupos que componen la cadena polipeptídica, y entre estos grupos y el medio enel cual se halla inserta. Estas fuerzas intra e intermoleculares también definen suestabilidad. Además, para que una proteína cumpla su función biológica, se requiere queconserve su estructura nativa. Estas observaciones muestran una estrecha relación entre laestructura, la estabilidad y la función de las proteínas, y sugieren que se pueden evaluarcaracterísticas estructurales y funcionales de las mismas a partir del estudio de suestabilidad. Este enfoque fue empleado en el estudio de la bomba de calcio de membranaplasmática (PMCA), una proteína integral de membrana, de Mr 134000, responsable deltransporte de Ca2+ hacia el exterior de células eucariotas. La energía requerida para estafunción proviene directamente de la hidrólisis del ATP. En una primera etapa, determinamos que la pérdida espontánea de la actividad Ca2+-ATPasa de la bomba de calcio purificada y reconstituida en micelas de fosfolípidosy detergente, sería consecuencia de la desnaturalización de la proteína. La inactivaciónsiguió una cinética de pseudo-primer orden, que estaria asociada a una transición entredos estados y ocurriría a través de un único mecanismo en el intervalo 33-45 °C. Dadoque el proceso es irreversible, el coeficiente cinético de la inactivación es inversamenteproporcional a la estabilidad de la enzima. Una vez caracterizado este proceso, estudiamos los cambios en la disposiciónestructural de la enzima durante la desnaturalización térmica. Para ello empleamos unanálisis combinado que incluyó el análisis de la fluorescencia de un conjunto de sondasespecíficas y ensayos de actividad enzimática. Establecimos que el dominio de unión acalmodulina se desnaturaliza antes que el dominio catalítico, en tanto que el dominiotransmembránico permanece plegado durante la desnaturalización térmica. Como la función vinculada a los distintos dominios es afectada por ligandosespecíficos de la enzima, exploramos el efecto de éstos en la estabilidad. Determinamosque Ca2+, calmodulina y un análogo no hidrolizable del ATP estabilizan al dominiocatalítico. Exploramos además el efecto de un ligando cuya relevancia sobre la estructuray función de la bomba no ha sido determinada, i.e., la propia bomba de calcio. Ladimerización fue caracterizada empleando la transferencia de energía entre la bomba decalcio marcada con la sonda fluorescente FITC y la marcada con EITC. El mecanismo molecular de la dimerización fue estudiado determinando laeficiencia de la transferencia de energía entre FITC-PMCA y EITC-PMCA luego dedesplegar distintas regiones de la enzima. Estos ensayos permitieron definir que ladimerización involucra la interacción entre el dominio de unión a calmodulina y dossegmentos de la bomba a las cuales se une el péptido C28W cuya secuencia se encuentraincluida en la del mencionado dominio. La relevancia biológica del proceso de dimerización fue estudiada determinando ladependencia de la estabilidad de la bomba de calcio con su concentración. El análisisteórico de los resultados obtenidos permitió determinar que la estabilidad de la bomba decalcio dimérica es 200 veces mayor que la monomérica. La estructura y función de las proteínas de membrana se encuentran íntimamenterelacionadas con los sistemas micelares en el cual se hallan insertas. Por este motivo,exploramos la dependencia de la estabilidad de la bomba purificada con la composiciónde las micelas. Basándose en los resultados obtenidos en tres sistemas micelaresdiferentes, postulamos un modelo que propone que la estabilidad de la enzima aumenta amedida que la monocapa de anfifilos que recubre la superficie hidrofóbica del dominiotransmembránico se enriquece en fosfolípidos. La composición de la monocapa estárelacionada con la afinidad de los fosfolípidos respecto a la del detergente por estasuperficie (KLD). Desarrollamos un método que permite determinar KLD utilizandotransferencia de energía entre los residuos triptofano de la PMCA y un fosfolípidomarcado con pireno. Los valores de KLD obtenidos por este procedimiento sonconsistentes con los determinados a partir del modelo. En conclusión, los resultados obtenidos en este trabajo de tesis sugieren que elestudio de la estabilidad de proteínas podría constituir una metodología general de granutilidad para explorar aspectos estructurales y funcionales de una amplia gama deproteínas.
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spelling tesis:tesis_n3348_Levi2023-10-02T19:47:44Z La estabilidad térmica de la bomba de calcio de membrana plasmática Thermal stability of the plasma membrane calcicum pump Levi, Valeria Rossi, Juan Pablo F. C. Gónzalez Flecha, Luis PROTEINA DE MEMBRANA ESTABILIDAD ESTRUCTURAL BOMBA DE CALCIO ATPASA DESNATURALIZACION TERMICA MEMBRANE PROTEIN STRUCTURAL STABILITY CALCIUM PUMP ATPASE THERMAL DENATURATION El estudio estructural y funcional de las proteínas de membrana se ve dificultadopor la gran complejidad de los sistemas en las cuales éstas se hallan insertas, y porque, engeneral, estas proteínas se inactivan espontáneamente. La estructura tridimensional de una proteína está determinada por la interacciónentre los grupos que componen la cadena polipeptídica, y entre estos grupos y el medio enel cual se halla inserta. Estas fuerzas intra e intermoleculares también definen suestabilidad. Además, para que una proteína cumpla su función biológica, se requiere queconserve su estructura nativa. Estas observaciones muestran una estrecha relación entre laestructura, la estabilidad y la función de las proteínas, y sugieren que se pueden evaluarcaracterísticas estructurales y funcionales de las mismas a partir del estudio de suestabilidad. Este enfoque fue empleado en el estudio de la bomba de calcio de membranaplasmática (PMCA), una proteína integral de membrana, de Mr 134000, responsable deltransporte de Ca2+ hacia el exterior de células eucariotas. La energía requerida para estafunción proviene directamente de la hidrólisis del ATP. En una primera etapa, determinamos que la pérdida espontánea de la actividad Ca2+-ATPasa de la bomba de calcio purificada y reconstituida en micelas de fosfolípidosy detergente, sería consecuencia de la desnaturalización de la proteína. La inactivaciónsiguió una cinética de pseudo-primer orden, que estaria asociada a una transición entredos estados y ocurriría a través de un único mecanismo en el intervalo 33-45 °C. Dadoque el proceso es irreversible, el coeficiente cinético de la inactivación es inversamenteproporcional a la estabilidad de la enzima. Una vez caracterizado este proceso, estudiamos los cambios en la disposiciónestructural de la enzima durante la desnaturalización térmica. Para ello empleamos unanálisis combinado que incluyó el análisis de la fluorescencia de un conjunto de sondasespecíficas y ensayos de actividad enzimática. Establecimos que el dominio de unión acalmodulina se desnaturaliza antes que el dominio catalítico, en tanto que el dominiotransmembránico permanece plegado durante la desnaturalización térmica. Como la función vinculada a los distintos dominios es afectada por ligandosespecíficos de la enzima, exploramos el efecto de éstos en la estabilidad. Determinamosque Ca2+, calmodulina y un análogo no hidrolizable del ATP estabilizan al dominiocatalítico. Exploramos además el efecto de un ligando cuya relevancia sobre la estructuray función de la bomba no ha sido determinada, i.e., la propia bomba de calcio. Ladimerización fue caracterizada empleando la transferencia de energía entre la bomba decalcio marcada con la sonda fluorescente FITC y la marcada con EITC. El mecanismo molecular de la dimerización fue estudiado determinando laeficiencia de la transferencia de energía entre FITC-PMCA y EITC-PMCA luego dedesplegar distintas regiones de la enzima. Estos ensayos permitieron definir que ladimerización involucra la interacción entre el dominio de unión a calmodulina y dossegmentos de la bomba a las cuales se une el péptido C28W cuya secuencia se encuentraincluida en la del mencionado dominio. La relevancia biológica del proceso de dimerización fue estudiada determinando ladependencia de la estabilidad de la bomba de calcio con su concentración. El análisisteórico de los resultados obtenidos permitió determinar que la estabilidad de la bomba decalcio dimérica es 200 veces mayor que la monomérica. La estructura y función de las proteínas de membrana se encuentran íntimamenterelacionadas con los sistemas micelares en el cual se hallan insertas. Por este motivo,exploramos la dependencia de la estabilidad de la bomba purificada con la composiciónde las micelas. Basándose en los resultados obtenidos en tres sistemas micelaresdiferentes, postulamos un modelo que propone que la estabilidad de la enzima aumenta amedida que la monocapa de anfifilos que recubre la superficie hidrofóbica del dominiotransmembránico se enriquece en fosfolípidos. La composición de la monocapa estárelacionada con la afinidad de los fosfolípidos respecto a la del detergente por estasuperficie (KLD). Desarrollamos un método que permite determinar KLD utilizandotransferencia de energía entre los residuos triptofano de la PMCA y un fosfolípidomarcado con pireno. Los valores de KLD obtenidos por este procedimiento sonconsistentes con los determinados a partir del modelo. En conclusión, los resultados obtenidos en este trabajo de tesis sugieren que elestudio de la estabilidad de proteínas podría constituir una metodología general de granutilidad para explorar aspectos estructurales y funcionales de una amplia gama deproteínas. Structural and functional studies on membrane proteins are limited by thecomplexity of the micellar system in which these proteins are inserted. In addition,these proteins undergo spontaneous inactivation. Protein structure is determined by intra and intermolecular forces that alsodefine its stability. Moreover, the proteins are biologically functional only if theypreserve their native structure. These observations show the close relation amongstructure, stability and function, and suggest that structural and functionalcharacteristics of a protein could be evaluated from stability studies. This approachwas applied to an integral membrane protein, i.e., the plasma membrane calcium pump (PMCA) reconstituted in mixed micelles of phospholipids and detergent. This proteinof Mr 134000 is responsible for the active Ca2+ transport through the membrane to theexternal milieu in the eukaryotic cells. Initially, we characterized the spontaneous lost of the Ca2+ ATPase activity, anddetermined that this process is a consequence of the enzyme denaturation. Theinactivation followed a first-order kinetics that could be associated with a transitionbetween the native and the denatured states with a common mechanism in the range 33-45 °C. Since this process was irreversible, the kinetic coefficient of the enzymeinactivation provides a measure of the enzyme stability. The structural domain organization of the enzyme was studied by using acombined spectroscopic and kinetic approach that allows the parallel evaluation of thestructural and functional changes occurring at specific regions of the protein. Weestablished that the calmodulin-binding domain unfolds earlier than the catalyticdomain while the transmembrane domain remains folded during thermal inactivation. Since specific ligands of the pump affect the enzyme function, we exploredtheir effects on protein stability. We determined that Ca2+, calmodulin and a nonhydrolyzableanalog of ATP increased the enzyme stability. In addition, we studied the effects of the plasma membrane calcium pump self-associationon the structural stability of the enzyme. Energy transfer measurementsbetween the enzyme labeled with the fluorescent probes FITC and EITC wereemployed to evaluate the dimer and monomer distributions as a function of the totalenzyme concentration. The enzyme thermal stability was assayed at differentdimer/monomer ratios and analyzed in terms of a model that considers the equilibriaamong dimers, monomers and mixed dimers formed by a thermal-inactivated and anactive monomers. Each of these species is inactivated following an irreversible step. The dimer stability was 200 fold higher that the stability of the monomeric enzymeindicating that thermal inactivation of the calcium pump proceeds mainly through themonomeric pathway. To explore the molecular mechanism of dimerization, energy transfer efficiencywas determined after the unfolding of different enzyme domains by using differentthermal treatments. We demonstrated the existence of two regions involved in the self-associationprocess: the calmodulin-binding domain and the C28W-binding regions. The structure and the function of membrane proteins are intimately related tothe micellar systems in which they are inserted. Therefore, we studied the calciumpump thermal stability in three micellar systems. The obtained results were explainedin terms of a model that considers that thermal stability of the pump depends on thecomposition of the amphiphile monolayer directly in contact with the transmembraneprotein surface. Application of this model shows that the maximal pump stability isattained when 80% of this surface is covered by phospholipids. This analysis alsoprovides an indirect measure of the relative affinity phospholipid/detergent for thehydrophobic transmembrane surface of the protein (KLD) showing that thosephospholipids with higher affinity provide greater stability to the Ca2+ pump. KLDvalues obtained by this procedure agreed with those obtained by measuringfluorescence resonance energy transfer from the protein tryptophan residues to apyrene-labeled phospholipid. In summary, the results shown in this thesis, suggest that the study of proteinstability could constitute a general methodology to explore structural and functionalproperties of membrane proteins. Fil: Levi, Valeria. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2001 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3348_Levi

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