Caracterización molecular y cariotípica de la variabilidad genética de germoplasma argentino de Solanum L.

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La papa cultivada se encuentra relacionada con un gran número de especiesdel género Solanum con las que frecuentemente se cruza. Por tal motivo, lasaproximadamente 200 especies silvestres que producen tuberculo, constituyenun importante reservorio de genes para distintos propósitos de mejoramiento....

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Marcucci Poltri, Susana N.
Otros Autores: Hopp, Horacio Esteban
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 1998
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3072_MarcucciPoltri
Aporte de:
Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description La papa cultivada se encuentra relacionada con un gran número de especiesdel género Solanum con las que frecuentemente se cruza. Por tal motivo, lasaproximadamente 200 especies silvestres que producen tuberculo, constituyenun importante reservorio de genes para distintos propósitos de mejoramiento. Las mismas se encuentran distribuidas en un amplio rango de hábitats y nichosecológicos, constituyendo el Noroeste argentino, una gran fuente degermoplasma. Es conocido que poseen gran variabilidad tanto dentro comoentre especies. La información sobre el grado de relación genética que existeentre las distintas entradas, reviste gran interés para las aplicaciones almejoramiento genético, organización de los bancos de germoplasma.identificación de cultivares, reducción del número de entradas necesarias paraque alberguen en una pequeña muestra, la mayor variabilidad genetica posible,para el mejoramiento molecular, etc. La variabilidad genetica puede medirse utilizando distintas herramientas lasque incluyen datos morfológicos, citológicos, bioquímicos y moleculares. Elobjetivo de este trabajo es evaluar la variabilidad genética de 67 entradassilvestres y cultivadas del género Solanum, coleccionadas en el Banco de Germoplasma de EEA INTA- Balcarce, aplicando metodologías citológicas ymoleculares y contrastar los resultados obtenidos con la clasificacióntaxonómica y su hipótesis evolutiva. Se analiza la utilidad de estasherramientas y la información generada mediante los polimorfismos derestricción correspondientes a los ADNs ribosomales. Se evaluó mediante microdensitometría, el contenido de ADN de individuospertenecientes a 14 especies silvestres del género Solanum con el fin dedetectar diferencias en el valor C. A pesar de que la mayoria de las especiesno mostró diferencias significativas entre ellas (dentro de los distintos gruposde ploidías), pequeñas diferencias fueron detectadas entre algunas de ellas. S.tarijense y S. kurzianum (2.3 pg) difirieron significativamente (0,1%) de S. Spegazzini, S. vernei, S. venturii y S. commersonii (1,9 pg); y S..megistacrobolum (2,2 pg) difirió de S. spegazzinii (1,9 pg) dentro de loscitotipos diploides. Entre los tetraploides el rango fue desde 3,6 pg (S.tuberosum ssp tuberosum cv. Baraka) hasta 4,7 pg (S. tuberosum sspandigena y S. gourlayi) hallándose diferencias significativas al 0,1%. En cuantoa la variabilidad de los genes que codifican para el ARN ribosomal, sedetectaron diferentes tamaños de las subunidades completas, tanto dentrocomo entre especies, y aún, dentro de una misma especie; sugiriendo una altatasa de mutaciones localizada fundamentalmente el extremo 5' del espaciadorexterno. La pérdida del sitio EcoRI del extremo 3'de dicho espaciador en todaslas entradas de S. venturii fue característica de dicha especie. El desarrollo de las nuevas metodologías ha expandido el rango de los ensayospara detectar polimorfismos de ADN con propósitos de "fingerprinting",distancias genéticas, etc. Se han desarrollado distintos marcadoresmoleculares (RFLP, AFLP, SSR etc) con el fin de estudiar las relacionesgenéticas y se evaluó su utilidad en varios cultivos, incluidos la papa cultivada, S. tuberosum ssp tuberosumm. En este trabajo, se ensayaron 4 combinacionesde "primers" de AFLP, 15 sondas genómicas de RFLP y 7 pares de "primers"para SSR; para un grupo de 67 genotipos diploides y poliploides quepertenecen al mismo grupo de especies silvestres y cultivadas. Se compararon las asociaciones generadas mediante todas las técnicas y se las comparó conla clasificación taxonómica tradicional. Se calcularon los indices de contenidopolimórfico promedios correspondiente a cada sistema (con valoresaproximados de 0,25 para RFLP, 0,32 para AFLP y 0.58 para SSR), númerode polimorfismos por ensayo y también se determinaron los alelos comunesentre las entradas diploides y poliploides, incluyendo al cultivar de papa. En términos generales, las relaciones entre las especies variaron según lametodología utilizada. Se observó una gran variabilidad dentro de especies, loque dificultó el establecimiento de las relaciones entre especies. Como seesperaba, las entradas pertenecientes a una misma especie, en general seagruparon con mayor similitud que entre especies, independientemente de latécnica utilizada. También se detectaron asociaciones de individuosconcordantes con la procedencia geográfica. Promediando todos los indices desimilitud obtenidos con los tres métodos. la especie que tuvo menor variabilidadfue S. venturii (0,681) y la de mayor variabilidad S. gourlayii(0,411). Los mejores valores de correlaciones entre los distintos sistemascorrespondieron a AFLP y SSR, en los dos grupos de ploidías, aunque loscoeficientes de correlación entre las matrices de similitud obtenidas mediantelas distintas herramientas no difirieron demasiado. Los valores de correlacionesen los citotipos diploides fueron desde 0,510 (RFLP vs SSR), 0,552 (RFLP vs AFLP), 0,640 (AFLP vs SSR). Considerando todos los citotiposindependientemente de la ploidía, los valores oscilaron desde 0,441 (RFLP vs SSR), 0,505 (RFLP vs AFLP) a 0,629 (AFLP vs SSR). Debido a los altos valores obtenidos en los coeficientes de correlacióncofenéticos (matrices de similitud vs. matrices cofenéticas, AFLP r=0.92; SSRr=0.85; RFLP r=0.78), las asociaciones entre los individuos pueden visualizarsedirectamente a partir del dendrograma. Los AFLP mostraron el mejor ajuste con la clasificación taxonómica, asociandodos especies que pertenecen a la misma serie Yungasensa (S. tarijense y S.chacoense), como así también agrupando más próximo al grupo de referenciaexterno tomate, a las entradas pertenecientes a S. commersonii, consideradacomo la especie más primitiva según la hipótesis propuesta por Hawkes, 1990. Esto quizás sea debido al gran número de bandas compartidas entre elgermoplasma y a la alta cobertura genómica. En el caso de RFLP, seobservaron algunos individuos dispersos, sugiriendo que sería necesarioevaluar un mayor número de sondas. Los SSR en general se utilizan para obtener información dentro de especies.pero no entre especies. Pudo observarse que la mayoria de los loci evaluadosprodujeron amplificaciones, indicando la conservación de las regionesflanqueantes. Sin embargo, el número de repeticiones, no fue muy conservadoentre las distintas especies, transformándolos en inapropiados para establecerrelaciones entre especies, pero si muy útiles dentro de especies. El análisis reverso de los datos, permitió la detección de bandas caracteristicasde especies y también de individuos. Casi todas las especies pudierondiscriminarse con estas bandas, y muchos de los individuos mostraron bandasúnicas. Se evaluaron asimismo el número de bandas novedosas respecto delcultivar Huinkul MAG, en especies como en individuos particulares, pudiendoidentificarse aquellas más distantes genéticamente, que serían potencialmenteinteresantes para aumentar las bases genéticas de los cultivares comerciales. También se determinó es grado de homocigosis de los distintos genotipos diploides, merced al uso de los marcadores de tipo codominantes (RFLP y SSR) mostrando un mínimo de homocigosis de 26% en S. goniocalyx megistacrolobum Oka 3787.
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La información sobre el grado de relación genética que existeentre las distintas entradas, reviste gran interés para las aplicaciones almejoramiento genético, organización de los bancos de germoplasma.identificación de cultivares, reducción del número de entradas necesarias paraque alberguen en una pequeña muestra, la mayor variabilidad genetica posible,para el mejoramiento molecular, etc. La variabilidad genetica puede medirse utilizando distintas herramientas lasque incluyen datos morfológicos, citológicos, bioquímicos y moleculares. Elobjetivo de este trabajo es evaluar la variabilidad genética de 67 entradassilvestres y cultivadas del género Solanum, coleccionadas en el Banco de Germoplasma de EEA INTA- Balcarce, aplicando metodologías citológicas ymoleculares y contrastar los resultados obtenidos con la clasificacióntaxonómica y su hipótesis evolutiva. Se analiza la utilidad de estasherramientas y la información generada mediante los polimorfismos derestricción correspondientes a los ADNs ribosomales. Se evaluó mediante microdensitometría, el contenido de ADN de individuospertenecientes a 14 especies silvestres del género Solanum con el fin dedetectar diferencias en el valor C. A pesar de que la mayoria de las especiesno mostró diferencias significativas entre ellas (dentro de los distintos gruposde ploidías), pequeñas diferencias fueron detectadas entre algunas de ellas. S.tarijense y S. kurzianum (2.3 pg) difirieron significativamente (0,1%) de S. Spegazzini, S. vernei, S. venturii y S. commersonii (1,9 pg); y S..megistacrobolum (2,2 pg) difirió de S. spegazzinii (1,9 pg) dentro de loscitotipos diploides. Entre los tetraploides el rango fue desde 3,6 pg (S.tuberosum ssp tuberosum cv. Baraka) hasta 4,7 pg (S. tuberosum sspandigena y S. gourlayi) hallándose diferencias significativas al 0,1%. En cuantoa la variabilidad de los genes que codifican para el ARN ribosomal, sedetectaron diferentes tamaños de las subunidades completas, tanto dentrocomo entre especies, y aún, dentro de una misma especie; sugiriendo una altatasa de mutaciones localizada fundamentalmente el extremo 5' del espaciadorexterno. La pérdida del sitio EcoRI del extremo 3'de dicho espaciador en todaslas entradas de S. venturii fue característica de dicha especie. El desarrollo de las nuevas metodologías ha expandido el rango de los ensayospara detectar polimorfismos de ADN con propósitos de "fingerprinting",distancias genéticas, etc. Se han desarrollado distintos marcadoresmoleculares (RFLP, AFLP, SSR etc) con el fin de estudiar las relacionesgenéticas y se evaluó su utilidad en varios cultivos, incluidos la papa cultivada, S. tuberosum ssp tuberosumm. En este trabajo, se ensayaron 4 combinacionesde "primers" de AFLP, 15 sondas genómicas de RFLP y 7 pares de "primers"para SSR; para un grupo de 67 genotipos diploides y poliploides quepertenecen al mismo grupo de especies silvestres y cultivadas. Se compararon las asociaciones generadas mediante todas las técnicas y se las comparó conla clasificación taxonómica tradicional. Se calcularon los indices de contenidopolimórfico promedios correspondiente a cada sistema (con valoresaproximados de 0,25 para RFLP, 0,32 para AFLP y 0.58 para SSR), númerode polimorfismos por ensayo y también se determinaron los alelos comunesentre las entradas diploides y poliploides, incluyendo al cultivar de papa. En términos generales, las relaciones entre las especies variaron según lametodología utilizada. Se observó una gran variabilidad dentro de especies, loque dificultó el establecimiento de las relaciones entre especies. Como seesperaba, las entradas pertenecientes a una misma especie, en general seagruparon con mayor similitud que entre especies, independientemente de latécnica utilizada. También se detectaron asociaciones de individuosconcordantes con la procedencia geográfica. Promediando todos los indices desimilitud obtenidos con los tres métodos. la especie que tuvo menor variabilidadfue S. venturii (0,681) y la de mayor variabilidad S. gourlayii(0,411). Los mejores valores de correlaciones entre los distintos sistemascorrespondieron a AFLP y SSR, en los dos grupos de ploidías, aunque loscoeficientes de correlación entre las matrices de similitud obtenidas mediantelas distintas herramientas no difirieron demasiado. Los valores de correlacionesen los citotipos diploides fueron desde 0,510 (RFLP vs SSR), 0,552 (RFLP vs AFLP), 0,640 (AFLP vs SSR). Considerando todos los citotiposindependientemente de la ploidía, los valores oscilaron desde 0,441 (RFLP vs SSR), 0,505 (RFLP vs AFLP) a 0,629 (AFLP vs SSR). Debido a los altos valores obtenidos en los coeficientes de correlacióncofenéticos (matrices de similitud vs. matrices cofenéticas, AFLP r=0.92; SSRr=0.85; RFLP r=0.78), las asociaciones entre los individuos pueden visualizarsedirectamente a partir del dendrograma. Los AFLP mostraron el mejor ajuste con la clasificación taxonómica, asociandodos especies que pertenecen a la misma serie Yungasensa (S. tarijense y S.chacoense), como así también agrupando más próximo al grupo de referenciaexterno tomate, a las entradas pertenecientes a S. commersonii, consideradacomo la especie más primitiva según la hipótesis propuesta por Hawkes, 1990. Esto quizás sea debido al gran número de bandas compartidas entre elgermoplasma y a la alta cobertura genómica. En el caso de RFLP, seobservaron algunos individuos dispersos, sugiriendo que sería necesarioevaluar un mayor número de sondas. Los SSR en general se utilizan para obtener información dentro de especies.pero no entre especies. Pudo observarse que la mayoria de los loci evaluadosprodujeron amplificaciones, indicando la conservación de las regionesflanqueantes. Sin embargo, el número de repeticiones, no fue muy conservadoentre las distintas especies, transformándolos en inapropiados para establecerrelaciones entre especies, pero si muy útiles dentro de especies. El análisis reverso de los datos, permitió la detección de bandas caracteristicasde especies y también de individuos. Casi todas las especies pudierondiscriminarse con estas bandas, y muchos de los individuos mostraron bandasúnicas. Se evaluaron asimismo el número de bandas novedosas respecto delcultivar Huinkul MAG, en especies como en individuos particulares, pudiendoidentificarse aquellas más distantes genéticamente, que serían potencialmenteinteresantes para aumentar las bases genéticas de los cultivares comerciales. También se determinó es grado de homocigosis de los distintos genotipos diploides, merced al uso de los marcadores de tipo codominantes (RFLP y SSR) mostrando un mínimo de homocigosis de 26% en S. goniocalyx megistacrolobum Oka 3787. Cultivated potato is related to a large number of Solanum sp and can easily behybridized. This makes that the two hundred wild and cultivated tuber-bearingspecies of the genus Solanum form a valuable gene reservoir for differentbreeding purposes. They are distributed in a wide variety of habitats andniches (North-West Argentina is a source of a great number of these species),there is high genetic variation within and between species. Information ongenetic relationships among accessions has several important applications forcrop improvement: organizing germplasm banks, identifying cultivars, reducingthe number of accessions needed to ensure a representative sample of broadrange of genetic variability, molecular breeding, etc. Genetic variability can be assessed in different ways including the comparisonof morphological, cytological, biochemical and molecular data. The objective ofthis work is to evaluate genetic variability of 67 wild and cultivated Solanumaccessions belonging to the germplasm bank of EEA INTA Balcarce applyingcytologic and molecular tools. The usefulness of this tools are comparedwith traditional taxonomy and its evolutive hypothesis. Ribosomal DNAcodingsequences are explored trough different restriction polymorphisms. Differentsubunits sizes were detected within and between species, and also in onespecie, showing a high mutation rate mainly in the 5' end of the externalspacer. All accessions of S. venturi showed the lost of an EcoRI restriction sitelocated in the 3' end of the external intergenic spacer. DNA content of individuals belonging to 14 wild Solanum species wasmeasured by microdensitometry to determine differences in their C value. Although most species did not show significant differences between them, slightdifferences could be detected between some of the species. Both S. tarijenseand S. kurzianum (2.3 pg) differ from S. spegazzinii, S. vernei, S. venturii and S. commersonii (1,9 pg); and S. megistacrolobum (2,2 pg) differ from S.spegazzini (1,9 pg) at diploid level. Tetraploids ranged from 3.6 pg (S.tuberosum ssp tuberosum cv. Baraka) were found at 0.1% level. New technological developments have expanded the range of DNApolymorphism assays for genome fingerprinting, genetic relatedness, etc. Different molecular markers (RFLP, AFLP, SSR, etc.) has been developed tostudy genetic relationships and their usefulness was compared in many cropspecies including cultivated potato Solanum tuberosum ssp tuberosum In this work, 67 genotypes (diploids as well as tetraploids) belonging to thesame group of wild and cultivated species, were assayed with, 15 RFLPgenomic probes, 4 AFLP primers combinations and 7 microsatellite primerspairs. Associations generated by each technique were compared as well ashow they fit with traditional taxonomy classification. Estimates of diversityindexes for each system (RFLP=O,25, O,32=AFLP and O,58=SSR), number ofpolymorphisms per assay as well as identification of common alleles betweendiploid and tetraploid accessions including cultivated potato were calculated. In general terms, quantification of relatedness between species varieddepending on the technique applied. It was observed a very high level ofvariation within species, making more difficult to establish relationships betweenspecies. As expected, accessions of the same species grouped at a higherlevel of similarity than with the rest of the germplasm, independently of themolecular tool used for evaluation. Genotypes belonging to the same geographic origin, were also grouped. S. gourlayí showed to be the mostvariable specie calculated on the bases of the three methodologies with the withthe smallest average similarity index (0,411) and the less variable was S.venturii with the highest average similarity index (0,681). Similarity indexes calculated on the bases of all three differentmethodologies were correlationed and r values were 0.510 (RFLP vs SSR), 0,552 (RFLP vs AFLP), 0,640 (AFLP vs SSR) for diploid species. Taking intoaccount all citotypes, r values ranged from 0.441 (RFLP vs SSR), 0,505 (RFLPvs AFLP) a 0,629 (AFLP vs SSR). As similarity matrixes are comparable with cophenetic matrixes (AFLP r=0.92; SSR r=0.85; RFLP r=0.78), this allows us to roughly visualize the associationsbetween accessions directly on dendograms. AFLP showed the best fit to taxonomic classification grouping two species (S.tarijense and S. chacoense) which belong to the same taxonomical serie Jungasensa, althogeter; also S. commersonii which is considered to be themost primitive taxon of this group (Hawkes. 1990) was grouped near theoutgroup tomato. This might be due to the higher proportion of shared bandsrespect to the other and the relative better coverage of genomes. In the case of RFLP, some accessions were dispersed, suggesting that more probes need tobe analyzed. SSR are usually used to obtain information within species and not betweenspecies, it was observed that the loci were conserved since amplification waspossible in many of the genotypes analyzed. However, microsatellite locishowed very little conservation of alleles in different species (as expected forthis very mutable loci) making them not appropriate for relatednessquantification when comparing different species while they keep theirusefulness within species. Reverse analysis of data allowed the detection of specie specific bands as wellas individuals ones. Nearly all of the species were able to be discriminated andmost of single individuals had unique bands. Novel bands not found in potatocultivar Huinkul MAG were also computed in all species and in individualsallowing the knowledge of the more distant ones, which might be interesting forincreasing genetic basis of commercial cultivars. Homozygous status of diploidsgenotypes were also estimated using codominant markers (RFLP and SSR)being of 36% for S. spegazzinii Oka 6108 and 64% for S. goniocalyx y S.megistacrolobums Oka 3787. Fil: Marcucci Poltri, Susana N.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 1998 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3072_MarcucciPoltri

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