Desarrollo de un Test de Diagnóstico Serológico para Hepatitis E

El virus de la hepatitis E (VHE) es la causa mundial más común de hepatitis aguda. Se estima que existen 20 millones de infecciones por año y 70 mil muertes relacionadas. La infección por el VHE generalmente es asintomática, pero puede presentarse como hepatitis aguda con recuperación o hepatitis fu...

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Autor principal: Arce, Lorena Paola
Otros Autores: Vizoso Pinto, María Guadalupe
Formato: Tesis
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad Nacional de Tucumán, Facultad de Medicina 2025
Materias:
Acceso en línea:https://ridunt.unt.edu.ar/handle/123456789/1644
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spelling I91-R383-123456789-16442025-09-01T12:33:23Z Desarrollo de un Test de Diagnóstico Serológico para Hepatitis E Arce, Lorena Paola Vizoso Pinto, María Guadalupe Virus de la Hepatitis E ELISA in house inmunoblot seroprevalencia factores de riesgo Ciencias biológicas Doctora en Ciencias Biológicas El virus de la hepatitis E (VHE) es la causa mundial más común de hepatitis aguda. Se estima que existen 20 millones de infecciones por año y 70 mil muertes relacionadas. La infección por el VHE generalmente es asintomática, pero puede presentarse como hepatitis aguda con recuperación o hepatitis fulminante; en inmunocomprometidos evoluciona a la cronicidad. Cuatro de los ocho genotipos del VHE (VHE-1, VHE-2, VHE-3 y VHE-4) afectan al humano, pero todos comparten el mismo serotipo. En Argentina hay escasos datos sobre la prevalencia de hepatitis E, sin embargo, se reportó que el genotipo 3 (VHE-3) circula en el país. Aún no hay datos epidemiológicos sobre hepatitis E en la provincia de Tucumán. El diagnóstico puede ser directo (sólo en centros de referencia) o indirecto mediante detección de anticuerpos. En Argentina, sólo un ELISA importado está disponible. El objetivo de esta tesis fue desarrollar un test de diagnóstico serológico para Hepatitis E para reemplazar importaciones y brindar herramientas para estudios epidemiológicos que permitan dimensionar la incidencia de la infección en nuestro país. Para ello, se clonó mediante tecnología Gateway, el principal antígeno del VHE (ORF2, la proteína que constituye la cápside del virus) de 4 genotipos en plásmidos de expresión bacteriana para fusionarlos a una etiqueta de RGS-His5. Se determinaron las condiciones óptimas para la expresión de la proteína ORF2 (cepa, concentración de IPTG, temperatura y tiempo de incubación) y se purificó la proteína en condiciones nativas y desnaturalizantes por cromatografía de afinidad (Ni-NTA). Se seleccionó la proteína ORF2 del VHE-3 obtenida en condiciones nativas para evaluar su potencial diagnóstico para la detección de anticuerpos en tres formatos de inmunoensayo diferentes (ELISA, NanoPOC e inmunoblot) utilizando muestras de suero caracterizadas previamente para hepatitis E. Para ponerlos a punto, se determinaron las condiciones óptimas para cada inmunoensayo (concentración de antígeno, dilución de suero y anticuerpo secundario, agente bloqueante y concentración de sustrato). Como resultado, el ELISA in house y el Inmunoblot permitieron detectar anticuerpos específicos para VHE (IgG e IgM) mientras que NanoPoc no fue efectivo. Se evaluó el desempeño del ELISA in house para detectar IgG anti-VHE con un panel de sueros caracterizados, obteniendo elevados valores de sensibilidad (93,33%; 95% IC: 77,9-99,2%), especificidad (99,4%; 95% IC: 96,7-100%), grado de correlación (índice kappa: 0,94; 95% IC: 0,87-1,00) y capacidad discriminativa en comparación con un ensayo gold standard (Dia.Pro, Italia). Se obtuvieron 1096 muestras de donantes de sangre y por primera vez se evidenciaron infecciones pasadas por VHE en la provincia de Tucumán con una seroprevalencia del 9,23% en 2017 y 5,26% en 2018. Mediante el test X2 no se encontró relación entre la seropositividad y edad, sexo, localidad, reactividad con otras infecciones transmitidas por sangre, pero si con viajes a países limítrofes, nivel de educación y trabajos de riesgo. En conclusión, en el presente trabajo de tesis se desarrolló y validó un test de ELISA para diagnosticar hepatitis E y realizar estudios epidemiológicos de seroprevalencia. Se puso a punto un ensayo confirmatorio de anticuerpos específicos (inmunoblot). Los resultados obtenidos en el estudio epidemiológico sugieren que el diagnóstico diferencial con hepatitis E debería incorporarse al diagnóstico de rutina de hepatitis virales. 2025-07-30T10:15:55Z 2020-05-29 Thesis https://ridunt.unt.edu.ar/handle/123456789/1644 es application/pdf Universidad Nacional de Tucumán, Facultad de Medicina
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description El virus de la hepatitis E (VHE) es la causa mundial más común de hepatitis aguda. Se estima que existen 20 millones de infecciones por año y 70 mil muertes relacionadas. La infección por el VHE generalmente es asintomática, pero puede presentarse como hepatitis aguda con recuperación o hepatitis fulminante; en inmunocomprometidos evoluciona a la cronicidad. Cuatro de los ocho genotipos del VHE (VHE-1, VHE-2, VHE-3 y VHE-4) afectan al humano, pero todos comparten el mismo serotipo. En Argentina hay escasos datos sobre la prevalencia de hepatitis E, sin embargo, se reportó que el genotipo 3 (VHE-3) circula en el país. Aún no hay datos epidemiológicos sobre hepatitis E en la provincia de Tucumán. El diagnóstico puede ser directo (sólo en centros de referencia) o indirecto mediante detección de anticuerpos. En Argentina, sólo un ELISA importado está disponible. El objetivo de esta tesis fue desarrollar un test de diagnóstico serológico para Hepatitis E para reemplazar importaciones y brindar herramientas para estudios epidemiológicos que permitan dimensionar la incidencia de la infección en nuestro país. Para ello, se clonó mediante tecnología Gateway, el principal antígeno del VHE (ORF2, la proteína que constituye la cápside del virus) de 4 genotipos en plásmidos de expresión bacteriana para fusionarlos a una etiqueta de RGS-His5. Se determinaron las condiciones óptimas para la expresión de la proteína ORF2 (cepa, concentración de IPTG, temperatura y tiempo de incubación) y se purificó la proteína en condiciones nativas y desnaturalizantes por cromatografía de afinidad (Ni-NTA). Se seleccionó la proteína ORF2 del VHE-3 obtenida en condiciones nativas para evaluar su potencial diagnóstico para la detección de anticuerpos en tres formatos de inmunoensayo diferentes (ELISA, NanoPOC e inmunoblot) utilizando muestras de suero caracterizadas previamente para hepatitis E. Para ponerlos a punto, se determinaron las condiciones óptimas para cada inmunoensayo (concentración de antígeno, dilución de suero y anticuerpo secundario, agente bloqueante y concentración de sustrato). Como resultado, el ELISA in house y el Inmunoblot permitieron detectar anticuerpos específicos para VHE (IgG e IgM) mientras que NanoPoc no fue efectivo. Se evaluó el desempeño del ELISA in house para detectar IgG anti-VHE con un panel de sueros caracterizados, obteniendo elevados valores de sensibilidad (93,33%; 95% IC: 77,9-99,2%), especificidad (99,4%; 95% IC: 96,7-100%), grado de correlación (índice kappa: 0,94; 95% IC: 0,87-1,00) y capacidad discriminativa en comparación con un ensayo gold standard (Dia.Pro, Italia). Se obtuvieron 1096 muestras de donantes de sangre y por primera vez se evidenciaron infecciones pasadas por VHE en la provincia de Tucumán con una seroprevalencia del 9,23% en 2017 y 5,26% en 2018. Mediante el test X2 no se encontró relación entre la seropositividad y edad, sexo, localidad, reactividad con otras infecciones transmitidas por sangre, pero si con viajes a países limítrofes, nivel de educación y trabajos de riesgo. En conclusión, en el presente trabajo de tesis se desarrolló y validó un test de ELISA para diagnosticar hepatitis E y realizar estudios epidemiológicos de seroprevalencia. Se puso a punto un ensayo confirmatorio de anticuerpos específicos (inmunoblot). Los resultados obtenidos en el estudio epidemiológico sugieren que el diagnóstico diferencial con hepatitis E debería incorporarse al diagnóstico de rutina de hepatitis virales.
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