Aislados de proteasas cisteínicas en distintas condiciones de crecimiento de Ananas comosus y Bromelia serra en Corrientes y su potencial uso agronómico
Algunas especies nativas de la familia de las Bromeliaceae se caracterizan por poseer endopeptidasas en cantidades superiores a las fisiológicamente necesarias, lo que constituye una potencialidad muy atractiva debido a los múltiples usos biotecnológicos que poseen dichas enzimas. Se ha comprobad...
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| Autor principal: | |
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| Otros Autores: | |
| Formato: | Tesis doctoral |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Agrarias
2025
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| Materias: | |
| Acceso en línea: | http://repositorio.unne.edu.ar/handle/123456789/58599 |
| Aporte de: |
| Sumario: | Algunas especies nativas de la familia de las Bromeliaceae se caracterizan por poseer
endopeptidasas en cantidades superiores a las fisiológicamente necesarias, lo que constituye
una potencialidad muy atractiva debido a los múltiples usos biotecnológicos que poseen
dichas enzimas. Se ha comprobado que la bromelina de tallo de Ananas comosus (L.) Merr.
posee múltiples usos como controlador de ciertos microorganismos fitopatógenos y
aplicaciones en la industria de los alimentos. Además, existen antecedentes que demuestran
que ante condiciones de estrés hídrico se estimula la expresión de genes que codifican para
la transcripción de cisteína proteasas en Arabidopsis thaliana, lo cual podría favorecer a un
aumento en el contenido de enzimas proteolíticas en la planta. En el caso de la especie
Bromelia serra Griseb., hasta el momento, existen escasos estudios acerca de la
caracterización de enzimas y su aplicación. Considerando la importancia creciente que han
adquirido las enzimas proteolíticas en la industria, los objetivos de esta investigación fueron:
i) analizar el perfil de proteasas cisteínicas existentes en aislados de hojas de B. serra en
distintas estaciones del año, ii) estudiar el comportamiento de proteasas cisteínicas de A.
comosus bajo distintas condiciones de estrés hídrico, iii) evaluar el uso de las proteasas
cisteínicas de Ananas comosus y Bromelia serra como producto orgánico para el control de
microorganismos fitopatógenos, y iv) evaluar el efecto de las enzimas de B. serra sobre la
coagulación de la leche bovina. Los resultados mostraron que las concentraciones de
proteínas y actividad enzimática obtenida a partir de hojas de B. serra no varió
estadísticamente en diferentes estaciones del año. La actividad proteolítica específica
(Ucas/mg de proteína) de los extractos de Bromelia serra aumentó al emplear la precipitación
con acetona y etanol en comparación al extracto crudo. Se detectaron cisteíno y asparto
proteasas en el aislado enzimático de Bromelia serra (AEB) utilizando técnicas de medición
de actividad en presencia de inhibidores. Se observó que el AEB presentó actividad en un
rango de pH de 2,7 a 7, mostrando mayor actividad en pH ácidos. Además, se evidenció una
alta estabilidad térmica en los AEB obteniendo un 47% de actividad residual luego de pre
incubar por una hora a 98°C. Asimismo, se alcanzó la máxima actividad proteolítica a una
temperatura de 60ºC. Se destaca la fácil inactivación del AEB frente al efecto de NaCl, lo que señala una sensibilidad particular de estas enzimas a las condiciones de alta salinidad.
Utilizando la cromatografía de exclusión molecular, se logró detectar en el AEB fraccciones
proteolíticas con pesos moleculares distintos de 21 y 54 kDa. Respecto al estudio del
comportamiento de proteasas cisteínicas de Ananas comosus bajo distintas condiciones de
estrés hídrico, se utilizaron como indicadores del estrés el NDVI y CRA, demostrando que
NDVI detecto el estrés hídrico (p<0,05) a los 2 meses de iniciado el ensayo entre
tratamientos. La caracterización de los extractos crudos de ananá de tallo (ECAt) y hoja
(ECAh), mostraron mayor actividad proteolítica sobre azocaseína y mayor concentración de
proteína al aumentar el estrés hídrico. Las técnicas utilizadas para caracterizar el peso
molecular de las proteínas y su actividad gelatinolítica permitieron detectar diferencias de
acuerdo al tipo de órgano y el nivel de estrés hídrico. En general, en el caso del ECAt se
detectaron varias proteínas a medida que aumentó el nivel de estrés hídrico, pero la banda
más marcada y con mayor actividad gelatinolítica fue la de 25 kDa. En el caso de del ECAh,
también se observaron varias proteínas, predominando la de peso molecular de 22 kDa con
mayor actividad gelatinolítica al aumentar el estrés hídrico. Al comparar los perfiles
cromatográficos de la bromelina comercial con los perfiles de aislado enzimático tallo
(AEAt) y hoja (AEAh) se encontró un pico con el mismo tiempo de retención (23 min). En
la bromelina comercial esa fracción contuvo proteínas de 16, 22 y 25 kDa (23 min). En el
caso del pico de AEAh se correspondió con una banda de 22 kDa y con el AEAt dos bandas
proteicas de 12 y 25 kDa (23 min). Los picos de retención (23 min) de ambos aislados
presentaron mayor actividad proteolítica el tratamiento estresado (25%CC) que en el no
estresado (100%CC). La actividad con LNPE (α-N-CBZ-L-lisin-p-nitrofenil éster) fue mayor
con los tratamientos estresados, tanto en hoja como en tallo, por lo que se podría inferir que
a mayor estrés hídrico hay mayor actividad de la bromelina del tallo. Respecto al uso de las
proteasas cisteínicas de A. comosus y B. serra como producto orgánico para el control de
microorganismos fitopatógenos en bacterias y en hongo (Xanthomonas axonopodis pv.
manihotis, X. citri pv. Citri, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Ralstonia
solanacearum, Pseudomonas syringae pv. Tomate y Fusarium oxysporum), no se detectó
inhibición con ninguno de los microorganismos estudiados. Por último, al estudiar efecto de
las enzimas de serra sobre la coagulación de la leche bovina, se prepararon en un ensayo
previo hidrolizados de caseína utilizando AEB a diferentes tiempos. El hidrolizado obtenido tras un tratamiento de 240 minutos exhibió la actividad antioxidante (ABTS) más elevada en
comparación con los demás tratamientos obteniendo un hidrolizado con un grado de
hidrólisis de 12% con un valor de TEAC de 1,10µM/mg e IC50 de 1,68 (mg/mL). Una vez
estudiado el efecto del AEB sobre la caseína, se procedió a los estudios de coagulación de la
leche, que si bien presentaron valores bajos pueden aumentarse concentrando el AEB. Estos
ensayos permiten sentar base para estudios futuros para la manufactura de quesos,
reemplazando el cuajo de origen animal, por vegetal. Posteriormente deberán realizarse
estudios correspondientes a pruebas de acidez, alcohol, enzima reductasa o también
denominada reducción del azul de metileno la leche y análisis sensorial a la manufactura de
quesos. Estos estudios realizados durante la tesis sientas las bases de que el aumento del
estrés hídrico en ananá aumenta la actividad de la bromelina de tallo y por otro lado al utilizar
AEB como una herramienta capaz de hidrolizar otros sustratos proteicos que puedan derivar
en péptidos con bioactividad como es la actividad antioxidante, entre otros usos en la
industria agroalimentaria. |
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