Etapas preliminares en la purificación de una Lectina tipo C del veneno de Crotalus durissus terrificus del NEA

Del veneno de Crotalus durissus terrificus (C.d.t) de especímenes de Brasil se purifico una lectina tipo C denominada convulxina (CVX), de la cual se estudio su capacidad agregante plaquetaria(AP) “in vitro”, demostrando que se une a la glicoproteína VI (GPVI) en las plaquetas (Francischetti, Saliou...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Fusco, Luciano Sebastián
Formato: Reunión
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad Nacional del Nordeste 2025
Materias:
Convulxina
Lectinas
Cascabel
Acceso en línea:http://repositorio.unne.edu.ar/handle/123456789/58111
Aporte de:
RIUNNE - Repositorio Institucional de la Universidad Nacional del Nordeste (UNNE) de Universidad Nacional del Nordeste
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El control de pureza de la fracción obtenida no fue el adecuado para ensayos farmacológicos rigurosos, de allí que se dio paso a nuevas estrategias de purificación que permitan alcanzar la calidad deseada. En el presente trabajo se presentan las etapas preliminares en la purificación exhaustiva de una lectina tipo C del veneno de C.d.terrificus, en el marco de una beca postdoctoral recientemente iniciada.Se trabajó con mezclas de venenos desecados del veneno de C.d.terrificus obtenido del Serpentario de la ciudad de Corrientes. Una muestra de veneno de 10 mg se disolvió en solución de Tris-HCl pH: 8 y posterior ultacentrifugación en tubos Amicon (50 kDa). La solución resultante se redujo a un volumen de 500μL que posteriormente se sembraron en una columna Q-FF (GE-Healthcare) instalada en un cromatógrafo líquido ÄKTAPrime Plus. Se diseño un programa con gradiente en el que la concentración de Tris-HCl 1M. Con las fracciones de elución se realizaron Electroforesis en gel de poliacrilamida (15%) en presencia de dodecyl sulfato de sodio (SDS-PAGE), teñidos con Coomassie Blue. Se determinó la actividad AP la que se midió a partir de un plasma rico en plaquetas (PRP), por método turbidimétrico. Para ello a 665 ul de PRP preincubados con 85 ul de la fracción seleccionada en PBS (1 mg/ml) durante 10 min. Por otro lado para control positivo de agregación se utilizo ADP en distintas concentraciones. Las mezclas posteriormente se agitaron a 37°C, la que se continuó por 5min. Luego de la formación de grumos por la agregación plaquetaria, se dejo reposar 5 min y se leyó turbidez del sobrenadante a 410 nm. Como control negativo, se midió la turbidez provocada por PBS y se calculó el % de inhibición inducida por la enzima. En un frotis con plaquetas tratadas se realizo la coloración clásica para hemograma May Grünwald-Giemsa. Se evaluó AH en pocillos de una placa de microtitulación, se colocaron 50 μL de solución TCS (Tris-CaCl2-NaCl) a pH 7 y luego se agregó 50 μL de veneno o proteína purificada en los pocillo.Por último, solución al 3% de glóbulos rojos humanos del grupo O Rh+ fueron añadidos a cada pocillo. Las lecturas se realizaron luego de una hora de incubación a temperatura ambiente. Los resultados fueron clasificados en hemoaglutinación completa y no hemoaglutinación. El veneno fue sometido a ultracentrifugación, así se eliminaron moléculas de peso molecular inferior a 50 Kda, posteriormente se aplicó a una columna de intercambio anionico Q-FF. De esta manera se realizo la separación de las proteínas que a pH 8 presentaban una carga neta positiva primer pico de las negativas que se representaron con tres picos en el cromatograma. Todas las fracciones de elución fueron testeadas con ensayos para determinar actividad hemoaglutinante y agregante plaquetaria. Solo las primeras fracciones fueron positivas evidenciado la presencia de lectinas. Dado que la proteína de interés eluyó en el pico A se puede preveer que esta presenta un punto isoeléctrico superior a 8 por no ser retenida en la columna cargada positivamente en un medio tamponado a pH 8. Cada fracción de elución fue sometida a electroforesis por SDS-PAGE. Las muestras correspondientes al primer pico, no retenido por la columna, presentaron dos bandas superiores a 97 KDa. Estos hallazgos coinciden con estudios realizados por otros autores donde se reporta una lectina de 110 KDa compatible con un comlejo (Alfa-Beta)4. Adicionalmente se evidencian bandas de bajo peso molecular aprox. 14KDa, si se tienen en cuenta que la solución de veneno fue en primera medida sometida a un proceso de ultrafiltraciones eliminando las proteínas de bajo peso molecular (50KDa) es altamente probable que sean parte de la estructura cuaternaria de las moléculas de alto peso molecular. Por esto concluimos que la combinación de dos métodos de separación de proteínas, ultrafiltración e intercambio anionico, condujo a la obtención un extracto rico en proteínas compatibles convulxina (aprox. 100 kDa). Sin embargo, resta confirmar si las bandas que se visualizan en la SDS-PAGE de masa molecular del orden de 15 kDa son cadenas pertenecientes a la proteína oligomérica ó si son extrañas a esta lectina de interés. 2025-08-20T10:43:43Z 2025-08-20T10:43:43Z 2016-06-15 Reunión Fusco, Luciano Sebastián, 2016. Etapas preliminares en la purificación de una Lectina tipo C del veneno de Crotalus durissus terrificus del NEA. En: XXII Comunicaciones Científicas y Tecnológicas. Corrientes: Universidad Nacional del Nordeste, p. 1-1. http://repositorio.unne.edu.ar/handle/123456789/58111 spa UNNE/PI/13CF01/AR. Corrientes/Proteínas de venenos ofidicos con potencial aplicación farmacológica openAccess http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/ application/pdf p. 1-1 application/pdf Universidad Nacional del Nordeste

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