Evaluación de los procesos involucrados en el arresto y re-ingreso al ciclo celular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes, con el fin de generar un protocolo de expansión de las mismas

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En el corazón humano, poco después del nacimiento, los cardiomiocitos (CM) se someten a una útima ronda de división seguida de un escape del ciclo celular. De aquí que, las células de este órgano tienen poca capacidad regenerativa después del daño miocárdico debido al bajo potencial de proliferación...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Santín Velazque, Natalia Lucía
Otros Autores:	Miriuka, Santiago Gabriel
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2024
Materias:	CELULAS MADRE PLURIPOTENTES INDUCIDAS CARDIOMIOCITOS DERIVADOS DE IPSC CICLO CELULAR PROLIFERACION INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS IPSC DERIVED CARDIOMYOCYTES CELL CYCLE PROLIFERATION
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7552_SantinVelazque https://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n7552_SantinVelazque_oai
Aporte de:	Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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description	En el corazón humano, poco después del nacimiento, los cardiomiocitos (CM) se someten a una útima ronda de división seguida de un escape del ciclo celular. De aquí que, las células de este órgano tienen poca capacidad regenerativa después del daño miocárdico debido al bajo potencial de proliferación de los cardiomiocitos. Dado que existe la posibilidad de generar in vitro células madre pluripotentes inducidas (iPSC), a partir de células adultas, transfectando genes cruciales para el mantenimiento de la pluripotencia y que estas poseen la capacidad de diferenciarse a las tres capas germinales, se pueden producir in vitro células a medida, con posibilidades nulas de rechazo. Así, es posible generar cardiomiocitos derivados de iPSC (CM-iPSC), los cuales poseen actividad contráctil espontánea y pueden generar potenciales de acción como una célula cardíaca. Estos desarollos en conjunto, conducen a un interés creciente en la producción de iPSC-CM humanos como una estrategia potencialmente prometedora para las terapias regenerativas. In vitro, los CM-iPSC salen del ciclo celular como lo hacen los cardiomiocitos in vivo. Esto puede ser un inconveniente al momento de pretender lograr una gran masa de células cardíacas como la que se necesitaría para hacer un implante en un tejido humano, ya que puede implicar la utilización de un número importante de iPSC como punto de partida. Se plantea como hipótesis de esta tesis que es posible incrementar el número de células cardíacas que pueden ser obtenidas en cultivo a partir de iPSC si se manipula la salida del ciclo celular. Para poner a prueba esta hipótesis se propone el estudio de diferentes estrategias moduladoras del ciclo celular en CM-iPSC humanos. Para ello se puso a punto un protocolo de diferenciación cardíaca en monocapa y se desarrollaron líneas celulares reporteras que permitieron el estudio del ciclo celular. En función de la bibliografía estudiada y de los ensayos realizados previamente en el grupo de investigación, se seleccionaron tres metodologías para evaluar la influencia de estas sobre el ciclo celular de los CM-iPSC. Se estudió el efecto producido por el tratamiento con: FGFa, SB203580 (inhibidor de p38), miR520a y medio condicionado por células mesenquimales (MSC). Además se evaluó la posibilidad de criopreservar y mantener una línea de CM-iPSC durante múltiples pasajes. Se observó aumento de la proliferación de CM-iPSC con el tratamiento con miR520a-mimic y se estudiaron los genes target regulados por el miR-520. Al evaluar el efecto del medio condicionado por MSC de cordón umbilical humano (WJ-MSC, Wharton’s Jelly Mesenchymal Stem Cells) se observó un aumento de la proliferación celular y por medio del estudio de la proteómica de este medio se plantea que este efecto podría estar relacionado las vías de Hippo, Hif-1 y Pi3K-Akt. Por último, se estudió el efecto sobre el ciclo celular de los CM-iPSC luego de criopreservar y resembrar las células. A las 24 hs se observa un aumento de la proliferación celular, la cual se ve disminuida a la semana. Fue posible congelar en nitrógeno líquido los CM-iPSC, descongelarlos y mantenerlos en cultivo. Además se pudieron volver a sembrar los CM-iPSC múltiples veces, pero a partir del día 70 los pasajes son menos eficientes ya que se observa un aumento de la muerte celular. Con el fin de estudiar cuáles son las vías efectoras del aumento del ciclo celular en los cardiomiocitos resembrados, se evaluó la expresión del ARNm por medio de ARN-seq Interesantemente, se observó genes relacionados con la vía de PI3K-Akt y la vía de Hippo, las cuales han sido reportadas previamente relacionadas con el ciclo celular.
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Estos desarollos en conjunto, conducen a un interés creciente en la producción de iPSC-CM humanos como una estrategia potencialmente prometedora para las terapias regenerativas. In vitro, los CM-iPSC salen del ciclo celular como lo hacen los cardiomiocitos in vivo. Esto puede ser un inconveniente al momento de pretender lograr una gran masa de células cardíacas como la que se necesitaría para hacer un implante en un tejido humano, ya que puede implicar la utilización de un número importante de iPSC como punto de partida. Se plantea como hipótesis de esta tesis que es posible incrementar el número de células cardíacas que pueden ser obtenidas en cultivo a partir de iPSC si se manipula la salida del ciclo celular. Para poner a prueba esta hipótesis se propone el estudio de diferentes estrategias moduladoras del ciclo celular en CM-iPSC humanos. Para ello se puso a punto un protocolo de diferenciación cardíaca en monocapa y se desarrollaron líneas celulares reporteras que permitieron el estudio del ciclo celular. En función de la bibliografía estudiada y de los ensayos realizados previamente en el grupo de investigación, se seleccionaron tres metodologías para evaluar la influencia de estas sobre el ciclo celular de los CM-iPSC. Se estudió el efecto producido por el tratamiento con: FGFa, SB203580 (inhibidor de p38), miR520a y medio condicionado por células mesenquimales (MSC). Además se evaluó la posibilidad de criopreservar y mantener una línea de CM-iPSC durante múltiples pasajes. Se observó aumento de la proliferación de CM-iPSC con el tratamiento con miR520a-mimic y se estudiaron los genes target regulados por el miR-520. Al evaluar el efecto del medio condicionado por MSC de cordón umbilical humano (WJ-MSC, Wharton’s Jelly Mesenchymal Stem Cells) se observó un aumento de la proliferación celular y por medio del estudio de la proteómica de este medio se plantea que este efecto podría estar relacionado las vías de Hippo, Hif-1 y Pi3K-Akt. Por último, se estudió el efecto sobre el ciclo celular de los CM-iPSC luego de criopreservar y resembrar las células. A las 24 hs se observa un aumento de la proliferación celular, la cual se ve disminuida a la semana. Fue posible congelar en nitrógeno líquido los CM-iPSC, descongelarlos y mantenerlos en cultivo. Además se pudieron volver a sembrar los CM-iPSC múltiples veces, pero a partir del día 70 los pasajes son menos eficientes ya que se observa un aumento de la muerte celular. Con el fin de estudiar cuáles son las vías efectoras del aumento del ciclo celular en los cardiomiocitos resembrados, se evaluó la expresión del ARNm por medio de ARN-seq Interesantemente, se observó genes relacionados con la vía de PI3K-Akt y la vía de Hippo, las cuales han sido reportadas previamente relacionadas con el ciclo celular. In the human heart, shortly after birth, cardiomyocytes (CMs) undergo a final round of division followed by an escape from the cell cycle. Therefore, the cells of this organ have little regenerative capacity after myocardial damage due to the low proliferation potential of cardiomyocytes. There is the possibility of generating induced pluripotent stem cells (iPSC) in vitro, from adult cells, transfecting crucial genes for the maintenance of pluripotency and these cells have the ability to differentiate into the three germ layers. Custom cells can be produced in vitro, with zero chance of rejection. Thus, it is possible to generate iPSC-derived cardiomyocytes (CM-iPSC), which have spontaneous contractile activity and can generate action potentials like a cardiac cell. Together, these developments lead to a growing interest in the production of human CM-iPSC as a potentially promising strategy for regenerative therapies, and in identifying factors playing relevant roles in the regulation of the hiPSC-CMs cell cycle. In vitro, CM-iPSCs exit the cell cycle as cardiomyocytes do in vivo. This can be a drawback when attempting to achieve a large mass of cardiac cells such as would be needed to make an implant in human tissue, since it may imply the use of a significant number of iPSCs as a starting point. It is proposed as a hypothesis of this thesis that it is possible to increase the number of cardiac cells that can be obtained in culture from iPSCs if the exit of the cell cycle is manipulated. To test this hypothesis, we propose the study of different cell cycle modulating strategies in human CM-iPSC. To this end, a monolayer cardiac differentiation protocol was developed and reporter cell lines were generated that allowed the study of the cell cycle. Based on the bibliography studied and the tests previously carried out in the research group, three methodologies were selected to evaluate their influence on the cell cycle of the CM-iPSC. We studied the effect produced by treatment with FGFa, p38 MAP kinase (SB203580), a mimic of microRNA miR520a and medium conditioned by mesenchymal stem cells (MSC). In addition, the possibility of cryopreserving and maintaining human CM-iPSC line during multiple passages was evaluated. Increased proliferation of CM-iPSC was observed with treatment with miR520a-mimic and target genes regulated by miR-520 were studied. When evaluating the effect of the conditioned media by human umbilical cord MSC (WJ-MSC), an increase in cell proliferation was observed. Through the study of the proteomics of this media it is suggested that this effect could be related to the pathways of Hippo, Hif-1 and Pi3K-Akt. Finally, the effect on the cell cycle of CM-iPSCs after cryopreserving and re-seeding the cells are studied. At 24 hours an increase in cell proliferation is observed, which is diminished after a week. It is possible to freeze CM-iPSCs in liquid nitrogen, thaw them and maintain them in culture. In addition, the CM-iPSCs could be reseeded multiple times, but from day 70 the passages are less efficient since an increase in cell death is observed. In order to study which are the effector pathways of the increase in the cell cycle in reseeded cardiomyocytes, the expression of mRNA was evaluated by means of RNA-seq Interestingly, genes related to the PI3K-Akt pathway, the Hippo pathway , which have been previously reported related to the cell cycle. Fil: Santín Velazque, Natalia Lucía. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7552_SantinVelazque spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar CELULAS MADRE PLURIPOTENTES INDUCIDAS CARDIOMIOCITOS DERIVADOS DE IPSC CICLO CELULAR PROLIFERACION INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS IPSC DERIVED CARDIOMYOCYTES CELL CYCLE PROLIFERATION Evaluación de los procesos involucrados en el arresto y re-ingreso al ciclo celular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes, con el fin de generar un protocolo de expansión de las mismas Evaluation of the processes involved in the arrest and re-entry into the cell cycle in cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells, in order to generate a protocol for their expansion info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion https://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n7552_SantinVelazque_oai

Evaluación de los procesos involucrados en el arresto y re-ingreso al ciclo celular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes, con el fin de generar un protocolo de expansión de las mismas

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