Regulación y relevancia de genes del sistema de defensa frente a estrés oxidativo en células madre pluripotentes

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Las células madre pueden dividirse preservando su identidad y diferenciarse a distintos tipos celulares. En particular, las células madre embrionarias (CME) derivan del macizo celular interno del blastocisto y son pluripotentes, lo que significa que pueden dar origen a células derivadas de las tres...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Petrone Parcero, María Victoria
Otros Autores: Guberman, Alejandra Sonia
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2021
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7165_PetroneParcero
http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n7165_PetroneParcero_oai
Aporte de:
Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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Parte fundamental de estos mecanismos de protección es el sistema de defensa frente al estrés oxidativo, cuya actividad está exacerbada en CMP y disminuye a lo largo de la diferenciación. Si bien su función y composición están muy estudiadas, aún no se conoce en profundidad la regulación de los genes involucrados en este sistema en CMP. En base a la hipótesis de que la expresión de algunos componentes de este sistema es regulada por los FT de pluripotencia, nos propusimos estudiar la expresión y regulación de ciertos genes clave. A partir de un primer screening detectamos algunos genes cuya transcripción resultó modulada en la diferenciación, tanto en líneas de CME como en CMP inducidas (CMPi), otro modelo de CMP. En esta tesis nos enfocamos en el gen de Sod1, perteneciente la familia de las Sod, primera línea de defensa frente a las especies reactivas de oxígeno; el gen de la Glutatión reductasa (Gsr), que cataliza la formación de glutatión reducido, crítico para la resistencia al estrés oxidativo y el mantenimiento de un ambiente reductor; y el gen de Hemo oxigenasa 1 (HO-1), responsable del catabolismo del grupo hemo y con un posible rol en la diferenciación de CMP y la generación de CMPi, además de su conocido efecto citoprotector. Para estudiar la regulación de estos genes por los FT de CMP utilizamos diferentes abordajes complementarios: analizamos su expresión en CME indiferenciadas y sometidas a diferenciación; mediante análisis bioinformáticos estudiamos la existencia de sitios de unión para estos FT y su interacción en regiones regulatorias de estos genes en CMP; evaluamos el efecto del silenciamiento de los FT mediante short hairpin RNA, sobre los niveles de ARNm y finalmente, analizamos el efecto de la expresión de dichos FT en sistemas heterólogos, tanto mediante ensayos de trans-activación sobre construcciones reporteras, como sobre el gen endógeno en una línea celular que expresa de manera inducible el FT Oct4. Encontramos que el gen de Sod1 es inducido por Oct4, Sox2 y Nanog, el de Gsr regulado negativamente por estos tres FT y el de HO-1, reprimido por Oct4. Por otro lado, se especula que además de su función enzimática clásica, HO-1 podría tener una función nuclear. Dado que detectamos HO-1 en el núcleo de CME y en base a su propuesto rol durante la diferenciación, hipotetizamos que está involucrada en la regulación génica que impacta en la diferenciación. En la última parte de este trabajo comenzamos a explorar este posible rol de HO-1 mediante análisis de su efecto sobre los FT de pluripotencia y sobre la organización dinámica de la cromatina en CME. Nuestros resultados preliminares sugieren que HO-1 podría tener un efecto sobre la distribución subnuclear de la proteína asociada a heterocromatina HP1. Finalmente, comenzamos a generar mediante CRISPR/Cas9, una línea de CME knockout para HO-1 que será una valiosa herramienta para dilucidar su función en el contexto de las CM. En síntesis, en esta tesis encontramos que los FT de pluripotencia regulan la expresión de importantes componentes del sistema de defensa frente al estrés oxidativo, resaltando una conexión entre la homeostasis redox y la identidad celular. Notablemente, esta relación no pareciera ser consecuencia de un mecanismo general, dado que detectamos genes de este sistema que se inducen y otros que se reprimen por los FT de CMP. Por otra parte, comenzamos a explorar el rol de HO-1 en CME y a generar una herramienta que será valiosa para este estudio. La posibilidad de disponer en el futuro de terapias basadas en este tipo de células depende en gran medida de su habilidad para mantener un genoma intacto y de la calidad de las células diferenciadas que derivan de éstas. A través del estudio aquí planteado, esperamos poder realizar un aporte a este promisorio campo. Stem cells have the ability to self-renew while preserving their identity and can also differentiate into specific cell-types. Particularly, embryonic stem cells (ES cells) derive from the blastocyst inner cell mass and are pluripotent stem cells (PS cells), which means that they are able to differentiate into all derivatives of the three primary germ layers. The transcription factors (TFs) Oct4, Sox2 and Nanog, are essential to maintain PS cells fundamental properties by inducing key genes to preserve the pluripotent state and repressing others involved in differentiation processes. PS cells have a set of mechanisms that ensure genomic stability avoiding damage propagation, which is critical to preserve the germ line and embryo development. A fundamental component of these protective mechanisms is the oxidative stress defense system; which activity is enhanced in PS cells and diminishes along the differentiation process. Even though its composition and function are well known, the regulation of the genes involved in the PS cells defense system has been poorly studied. Based on the hypothesis that the expression of some components of this system is regulated by the pluripotency TFs, we investigated the expression and regulation of some key genes of the oxidative stress system. Over a first screening, we detected some genes modulated along differentiation, both in ES cell lines and in induced PS (iPS) cells, another PS cells model. In this thesis we focused on the Superoxide dismutase 1 (Sod1) gene, member of the Sod family that constitutes the first defense line against reactive oxygen species; the Glutathione-disulfide Reductase (Gsr) gene, which encodes the enzyme that catalyzes GSH formation, a critical molecule for oxidative stress resistance and the maintenance of a reducing environment; the Heme oxygenase 1 (HO-1) gene, responsible of heme catabolism and a with a proposed role during PS cells differentiation and iPS cells generation, beyond its well-known cytoprotective effect. To study the possible regulation of these genes by the pluripotency TFs, we used different and complementary approaches: we analyzed their expression in undifferentiated ES cells and in ES cells subjected to differentiation protocols; by bioinformatic analysis, we studied the existence of binding sites for these TFs and their interaction with regulatory regions of these genes in PS cells; we evaluated the effect of their down-regulation by a short hairpin RNA approach, on mRNA levels; and finally, we analyzed the effect of overexpressing these TFs in heterologous systems, both by trans-activation assays on reporter constructions, and on the endogenous gene in a cell line that expresses Oct4 in an inducible manner. We found that Sod1 gene is induced by Oct4, Sox2 and Nanog, Gsr gene is negatively modulated by these TFs and HO-1 gene is repressed by Oct4. On the other hand, it is speculated that in addition to its classical enzymatic function, HO-1 could have a nuclear function. Given that we have detected HO-1 signal in ES cell’s nucleus and based on its proposed role during the differentiation, we hypothesized that it has a role in gene regulation that impacts in differentiation. In the last part of this work, we started to explore this putative nuclear function through analysis of HO-1 effect over pluripotency TFs and over chromatin dynamical organization in ES cells. Our preliminary results suggest that HO-1 might influence the subnuclear distribution of HP1, a protein associated to heterochromatin. Further, using CRISPR/Cas9 technology, we also started to generate a HO-1 knockout ES cell line that would be a valuable tool to elucidate HO-1 function in the context of ES cells. In summary, in the present work we found that the pluripotency TFs modulate the expression of relevant components of the oxidative stress defense system, highlighting the connection between redox homeostasis and cellular identity. Interestingly, this link does not seem to be consequence of a general mechanism given the fact that we have detected genes of this system that are induced and others, repressed by pluripotency TFs. Moreover, we started to explore the HO-1 role in ES cells and to generate a valuable tool for this research. The possibility of having PS cells-based therapies in the future depends overall in their ability to keep an intact genome and also in the quality of differentiated cells obtained. We hope that our results contribute to this promising field. Fil: Petrone Parcero, María Victoria. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7165_PetroneParcero spa Universidad de Buenos Aires. 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