Mecanismos involucrados en la inducción de leptina por estradiol en células placentarias

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La leptina presenta un papel importante en la reproducción, principalmente se ha sugerido que presenta funciones importantes en la placenta durante la gestación, donde se detectó su expresión y la de sus receptores. En mujeres embarazadas el nivel de leptina en suero aumenta en comparación a las no...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Schanton, Malena
Otros Autores:	Varone, Cecilia
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2018
Materias:	LEPTINA ESTRADIOL PLACENTA SP1 NFKB VIA DE SEÑALIZACION DE PKA ACETILACION DE HISTONAS
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6362_Schanton http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n6362_Schanton_oai
Aporte de:	Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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description	La leptina presenta un papel importante en la reproducción, principalmente se ha sugerido que presenta funciones importantes en la placenta durante la gestación, donde se detectó su expresión y la de sus receptores. En mujeres embarazadas el nivel de leptina en suero aumenta en comparación a las no embarazadas, principalmente durante el segundo y tercer trimestre; aún antes de que se incremente el tejido adiposo. Originalmente la leptina, proteína de 16 kDa codificada por el gen LEP, fue descripta como una molécula producida por el tejido adiposo involucrada en la regulación del metabolismo al nivel central. La leptina placentaria podría tener efectos sobre el crecimiento, la angiogénesis y la inmunomodulación afectando tanto funciones maternas como fetales. En este trabajo, se analizó el efecto del 17β‐estradiol (E2) y las vías de señalización y factores de transcripción involucrados, sobre la expresión de la leptina en la placenta humana utilizando dos modelos experimentales, la línea celular BeWo, derivada de coriocarcinoma, y explantos de placentas normales humanas a término. Al analizar la importancia del factor de transcripción Sp1 sobre la regulación de la expresión de leptina mediada por estradiol, pudimos demostrar que la sobreexpresión de este factor incrementa la expresión de leptina determinada por Western blot. Más aún la sobreexpresión de un vector de expresión para Sp1 incrementa tanto la actividad basal del promotor de leptina como la inducida por E2. Específicamente aumenta la actividad de la región del promotor de leptina comprendida entre ‐1951 y ‐1887pb que contiene al “enhancer” placentario de leptina (PLE). Estos resultados fueron confirmados al utilizar un inhibidor de Sp1, el ácido betulínico. En estos experimentos se pierde el efecto inductor de Sp1 sobre la expresión de leptina placentaria. La acción ejercida por este factor de transcripción sobre la expresión de leptina es dependiente de ERα ya que en las células que expresan un siRNA contra este receptor la sobreexpresión de Sp1 no tiene efecto alguno sobre la expresión de leptina. Además al utilizar un vector reportero que contiene el sitio halfERE mutado, la acción de Sp1 parecería anularse. Por otro lado al utilizar un vector que presenta el promotor de leptina con el sitio de unión para Sp1 mutado, la sobreexpresión de ERα no es capaz de inducir la expresión de leptina. Estos resultados sugieren que es necesario que se encuentre intacto el sitio de Sp1 para que se pueda evidenciar el efecto de ERα sobre la expresión de leptina placentaria. Además se evalúo la posible interacción de ERα y Sp1 por inmunoprecipitación. Se demostró que hay interacción entre ambas proteínas, ya que al inmunoprecipitar ERα, se puede evidenciar la presencia de Sp1 en el inmunoprecipitado, y al inmunoprecipitar Sp1 se puede observar ERα en el inmunoprecipitado. Lo que sugiere que habría un efecto cooperativo entre ambos factores en la inducción de la expresión de la leptina placentaria. El antagonista estrogénico, ICI 182,780 no generó inhibición alguna sobre el efecto del Sp1 sobre la expresión de leptina placentaria, lo que sugeriría que la inducción de Sp1 sobre la expresión de leptina no estaría siendo afectada por el inhibidor ICI 182,780. Encontramos también que la expresión basal e inducida por E2 se ve disminuida con el tratamiento con el inhibidor del factor NFκB, sulfasalazina, sugiriendo la participación de los dímeros del NFκB en los efectos regulatorios de dicho esteroide. A través de transfecciones transitorias hemos observado que la sobreexpresión de la subunidad p65 (Rel-‐A) aumenta la actividad transcripcional basal del promotor de leptina y por otro lado la sobreexpresión de Rel-‐A en las células BeWo-‐Sh2, que poseen los niveles de ERα disminuidos por la estrategia de siRNA, produce una marcada disminución de la actividad basal del promotor de leptina, sugiriendo que el efecto de la sobreexpresión de p65 sobre el nivel basal de actividad del reportero sería dependiente de la expresión de ERα ya que al disminuir los niveles de este receptor el efecto de p65 se suprime. Por otro lado la sobreexpresión de p65 no estaría afectando la expresión de leptina mediada por E2 en presencia o ausencia de ERα. Se ha evaluado también la presencia y localización de ERy la subunidad p65 en las células BeWo, por ensayo de inmunofluorescencia y su posible interacción por coinmunoprecipitación. Hemos encontrado que ambas proteínas se encuentran localizadas en el citoplasma y cuando son sobreexpresadas migran al núcleo. Por otro lado determinamos que en las células BeWo estos dos factores de transcripción estarían interactuando, ya que al inmunoprecipitar ER, se pudo observar p65 en el inmunoprecipitado. Lo que sugiere que existiría un efecto cooperativo entre el ER y el NFκB. Hemos observado que el incremento de la expresión de leptina por estradiol en células BeWo depende de la integridad de la vía de señalización mediada por PKA, debido a que tratando a las células con inhibidores de ésta vía, H89 y SQ22536 se produce una disminución de su efecto. También observamos que la sobreexpresión de mutantes dominantes negativas para el factor de transcripción CREB anulan el efecto de estradiol sobre la expresión de leptina placentaria. Por otro lado la sobreexpresión de CBP, produce una estimulación del efecto inductor de estradiol, mientras que la sobreexpresión con HDAC, una deacetilasa de histonas, genera el efecto contrario. El tratamiento con tricostatina A (TSA), un inhibidor de la actividad acetiltransferasa, contrarresta el efecto de HDAC‐1. Esto indicaría que la regulación de la expresión de leptina por estradiol sería un proceso multifactorial que involucraría la activación de la vía de señalización de PKA y la modificación de la acetilación de histonas. Los resultados obtenidos contribuyen a mejorar la compresión de la expresión de leptina en la placenta humana así como las vías de señalización y factores de transcripción que actúan en la acción del E2 sobre la expresión de la misma.
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spelling	I28-R145-tesis_n6362_Schanton_oai2023-04-26 Varone, Cecilia Schanton, Malena 2018-03-21 La leptina presenta un papel importante en la reproducción, principalmente se ha sugerido que presenta funciones importantes en la placenta durante la gestación, donde se detectó su expresión y la de sus receptores. En mujeres embarazadas el nivel de leptina en suero aumenta en comparación a las no embarazadas, principalmente durante el segundo y tercer trimestre; aún antes de que se incremente el tejido adiposo. Originalmente la leptina, proteína de 16 kDa codificada por el gen LEP, fue descripta como una molécula producida por el tejido adiposo involucrada en la regulación del metabolismo al nivel central. La leptina placentaria podría tener efectos sobre el crecimiento, la angiogénesis y la inmunomodulación afectando tanto funciones maternas como fetales. En este trabajo, se analizó el efecto del 17β‐estradiol (E2) y las vías de señalización y factores de transcripción involucrados, sobre la expresión de la leptina en la placenta humana utilizando dos modelos experimentales, la línea celular BeWo, derivada de coriocarcinoma, y explantos de placentas normales humanas a término. Al analizar la importancia del factor de transcripción Sp1 sobre la regulación de la expresión de leptina mediada por estradiol, pudimos demostrar que la sobreexpresión de este factor incrementa la expresión de leptina determinada por Western blot. Más aún la sobreexpresión de un vector de expresión para Sp1 incrementa tanto la actividad basal del promotor de leptina como la inducida por E2. Específicamente aumenta la actividad de la región del promotor de leptina comprendida entre ‐1951 y ‐1887pb que contiene al “enhancer” placentario de leptina (PLE). Estos resultados fueron confirmados al utilizar un inhibidor de Sp1, el ácido betulínico. En estos experimentos se pierde el efecto inductor de Sp1 sobre la expresión de leptina placentaria. La acción ejercida por este factor de transcripción sobre la expresión de leptina es dependiente de ERα ya que en las células que expresan un siRNA contra este receptor la sobreexpresión de Sp1 no tiene efecto alguno sobre la expresión de leptina. Además al utilizar un vector reportero que contiene el sitio halfERE mutado, la acción de Sp1 parecería anularse. Por otro lado al utilizar un vector que presenta el promotor de leptina con el sitio de unión para Sp1 mutado, la sobreexpresión de ERα no es capaz de inducir la expresión de leptina. Estos resultados sugieren que es necesario que se encuentre intacto el sitio de Sp1 para que se pueda evidenciar el efecto de ERα sobre la expresión de leptina placentaria. Además se evalúo la posible interacción de ERα y Sp1 por inmunoprecipitación. Se demostró que hay interacción entre ambas proteínas, ya que al inmunoprecipitar ERα, se puede evidenciar la presencia de Sp1 en el inmunoprecipitado, y al inmunoprecipitar Sp1 se puede observar ERα en el inmunoprecipitado. Lo que sugiere que habría un efecto cooperativo entre ambos factores en la inducción de la expresión de la leptina placentaria. El antagonista estrogénico, ICI 182,780 no generó inhibición alguna sobre el efecto del Sp1 sobre la expresión de leptina placentaria, lo que sugeriría que la inducción de Sp1 sobre la expresión de leptina no estaría siendo afectada por el inhibidor ICI 182,780. Encontramos también que la expresión basal e inducida por E2 se ve disminuida con el tratamiento con el inhibidor del factor NFκB, sulfasalazina, sugiriendo la participación de los dímeros del NFκB en los efectos regulatorios de dicho esteroide. A través de transfecciones transitorias hemos observado que la sobreexpresión de la subunidad p65 (Rel-‐A) aumenta la actividad transcripcional basal del promotor de leptina y por otro lado la sobreexpresión de Rel-‐A en las células BeWo-‐Sh2, que poseen los niveles de ERα disminuidos por la estrategia de siRNA, produce una marcada disminución de la actividad basal del promotor de leptina, sugiriendo que el efecto de la sobreexpresión de p65 sobre el nivel basal de actividad del reportero sería dependiente de la expresión de ERα ya que al disminuir los niveles de este receptor el efecto de p65 se suprime. Por otro lado la sobreexpresión de p65 no estaría afectando la expresión de leptina mediada por E2 en presencia o ausencia de ERα. Se ha evaluado también la presencia y localización de ERy la subunidad p65 en las células BeWo, por ensayo de inmunofluorescencia y su posible interacción por coinmunoprecipitación. Hemos encontrado que ambas proteínas se encuentran localizadas en el citoplasma y cuando son sobreexpresadas migran al núcleo. Por otro lado determinamos que en las células BeWo estos dos factores de transcripción estarían interactuando, ya que al inmunoprecipitar ER, se pudo observar p65 en el inmunoprecipitado. Lo que sugiere que existiría un efecto cooperativo entre el ER y el NFκB. Hemos observado que el incremento de la expresión de leptina por estradiol en células BeWo depende de la integridad de la vía de señalización mediada por PKA, debido a que tratando a las células con inhibidores de ésta vía, H89 y SQ22536 se produce una disminución de su efecto. También observamos que la sobreexpresión de mutantes dominantes negativas para el factor de transcripción CREB anulan el efecto de estradiol sobre la expresión de leptina placentaria. Por otro lado la sobreexpresión de CBP, produce una estimulación del efecto inductor de estradiol, mientras que la sobreexpresión con HDAC, una deacetilasa de histonas, genera el efecto contrario. El tratamiento con tricostatina A (TSA), un inhibidor de la actividad acetiltransferasa, contrarresta el efecto de HDAC‐1. Esto indicaría que la regulación de la expresión de leptina por estradiol sería un proceso multifactorial que involucraría la activación de la vía de señalización de PKA y la modificación de la acetilación de histonas. Los resultados obtenidos contribuyen a mejorar la compresión de la expresión de leptina en la placenta humana así como las vías de señalización y factores de transcripción que actúan en la acción del E2 sobre la expresión de la misma. Leptin plays an important role in reproduction, mainly, it has been suggested to have functions in the placenta during gestation, where leptin and leptin receptors expression were detected. In pregnant women the level of serum leptin increases compared to non-‐pregnant women, mainly during second and third trimesters, even before the adipose tissue is increased. Originally leptin, a 16,000 MW protein product of the LEP gen, was described as an adipocyte-derived signaling molecule for the central control of metabolism. Leptin may have effects on growth, angiogenesis and immunomodulation affecting both maternal and fetal functions. In the present work, we analyzed the mechanism of action of 17β‐estradiol (E2) on the expression of leptin in the human placenta. In particular the signaling pathways and transcription factors involved were studied using two experimental models, the BeWo cells line, derived from choriocarcinoma, and placental explants from normal human placenta at term. From an in silico analysis of the leptin promoter potential binding sites for transcription factor CREB, NFκB and Sp1, were determined as well as estrogen responsive elements (ERE and half ERE). When analysing the importance of the transcription factor Sp1 on estradiol mediated leptin expression, we could demonstrate that the overexpression of this factor increases leptin expression determined by Western Blot Moreover the overexpression of Sp1 increases basal and estradiol induced leptin expression. Specifically, Sp1 activity increases leptin promoter transcription when a construction containing the promoter region between -‐1951 and ‐1887 bp containing the placental leptin enhancer was used. These results were confirmed using a Sp1 inhibitor, the butilinic acid. In these experiments the Sp1 inductive effect on leptin expression was lost. We have determined that the overexpression of Sp1 and ERα has a synergistic effect on leptin expression. We also observed that Sp1 transcription factor inductive effect on leptin expression is abolished in BeWo‐Sh2 cells, expressing a siRNA against ERα. Moreover, the ERα inducing effect on leptin expression is lost when a construct containing a mutated Sp1 biding site is used. Suggesting that it is necessary an intact Sp1 site in order to evidence ERα effect on placental leptin expression. On the other side, when using a reporter vector containing a mutated half ERE site, Sp1 inductive effect on leptin expression was abolished. These results together indicate that there would be a joint action between the transcription factor Sp1 and ERα that would regulate the expression of placental leptin. In addition, the possible interaction of ERα and Sp1 was evaluated by immunoprecipitation. It was demonstrated that there is an interaction between both proteins, as in the immunoprecipitate of ERα, Sp1 can be revealed and viceversa. These results suggest that there would be a cooperative effect between both factors in inducing the expression of placental leptin. However, the estrogenic antagonist, ICI 182,780 did not generate any inhibition on Sp1 effect on leptin placental expression, which would suggest that Sp1 effect on leptin induction is ICI 182,780 insensitive. Studying the influence of the transcription factor NFκB on leptin expression, we find that basal and induced leptin expression is diminished by sulfasalazine treatment, an inhibitor of the I. These results suggest the participation of NFκB dimers in the regulatory effects of this steroid. Through transient transection analysis we have observed that the overexpression of p65 subunit (Rel-‐A) increases basal transcriptional activity of leptin promoter. On the other hand the overexpression of p65 subunit in BeWo-‐Sh2 cells that have diminished ERα levels by siRNA strategy, produces a significant decrease both in basal leptin promoter activity. These results suggest that the effect of p65 overexpression is ERα dependent as it is suppressed when ERα is downregulated. The overexpression of p65would not be affecting estradiol leptin induction neither in the presence or the absence of ERα The presence and subcellular localization of ERα and p65 subunit have been evaluated in BeWo cells by immunofluorescence assay. Their possible interaction was assessed by coimmunoprecipitation. We have found that both proteins are located in the cytoplasm and when they are overexpressed, they migrate to the nucleus. On the other hand they probably interact forming a complex as p65 could be revealed in ERα immunoprecipitate. These results suggest that there would be a cooperative effect between ERα and NFκB. It was evidenced that estradiol effect on placental leptin expression is dependent on PKA signal transduction pathway integrity. We observed that treatment with the pharmacological inhibitors H89 and SQ22536 diminished estradiol leptin induction. We determined that the overexpression of dominant negative CREB mutants also diminished estradiol effect on placental leptin induction. On the other hand, the overexpression of CBP produces a stimulation of estradiol inducing effect, whereas the overexpression with HDAC-1, a histone deacetylase, generates the opposite effect. Also the treatment with tricostastin A (TSA), a deacetylase inhibitor, counteracts the effect of HDAC-1. These results indicate that estradiol leptin expression regulation would be a multifactorial process that would involve the activation of the cAMP signaling pathway and possibly the modification of histone acetylation. The results obtained contribute to increase the understanding of the mechanisms of leptin expression regulation in human placenta as well as the signaling pathway and transcription factors that act on estradiol leptin expression regulation. Fil: Schanton, Malena. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6362_Schanton spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar LEPTINA ESTRADIOL PLACENTA SP1 NFKB VIA DE SEÑALIZACION DE PKA ACETILACION DE HISTONAS Mecanismos involucrados en la inducción de leptina por estradiol en células placentarias Mechanisms involved in leptin induction by estradiol in placental cells info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n6362_Schanton_oai

Mecanismos involucrados en la inducción de leptina por estradiol en células placentarias

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