Eriptosis. Mecanismos involucrados y efecto protector de la eritropoyetina
Los procesos inflamatorios, frecuentemente asociados a anemia de enfermedades crónicas, podrían cumplir un rol en la inhibición de la eritropoyesis. La existencia de señales intracelulares comunes entre los procesos que regulan la eritropoyesis y la respuesta inflamatoria sugiere que la desregulació...
Guardado en:
| Autor principal: | |
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| Otros Autores: | |
| Formato: | Tesis doctoral publishedVersion |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
2012
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ERITROCITOS ANEMIA ERIPTOSIS ESTRES OXIDATIVO ERITROPOYETINA CALCIO INTRACELULAR CITOQUINAS PROINFLAMATORIAS ALUMINIO ERYTHROCYTES ANEMIA ERYPTOSIS OXIDATIVE STRESS ERYTHROPOIETIN INTRACELLULAR CALCIUM PROINFLAMMATORY CYTOKINES ALUMINUM TOXICITY |
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Los procesos inflamatorios, frecuentemente asociados a anemia de enfermedades crónicas, podrían cumplir un rol en la inhibición de la eritropoyesis. La existencia de señales intracelulares comunes entre los procesos que regulan la eritropoyesis y la respuesta inflamatoria sugiere que la desregulación de un sistema podría explicar la disminución de la función del otro. Por otro lado, un daño directo sobre los eritrocitos maduros en circulación, causado por factores presentes en dichos procesos, podría contribuir también al desarrollo de anemia. Teniendo en cuenta que la identificación de factores que pueden afectar la sensibilidad de células eritroides a las diferentes señales recibidas permitiría conocer la interferencia de la inflamación en la eritropoyesis, se planteó como primer objetivo, dilucidar la interrelación entre diferenciación eritroide y apoptosis. Se observó una mayor sensibilidad de la línea eritroleucémica humana K562 a la acción proapoptótica de citoquinas proinflamatorias, como TNF-α e IL-1β, cuando las células se encontraban en etapa de diferenciación eritroide. El estudio de los mecanismos involucrados permitió sugerir, por primera vez, una posible explicación del efecto de TNF-α e IL-1β basada en la disminución de los niveles de la proteína antiapoptótica c-FLIP observada durante la diferenciación con hemina. Más aún, el tratamiento previo con el factor de crecimiento eritropoyetina (Epo) de las células inducidas a diferenciación eritroide las protegió de la acción proapoptótica a la vez que se detectó la modulación positiva de c-FLIP. La Epo contrarrestaría los cambios en las vías de señalización producidos durante el proceso de diferenciación eritroide permitiendo a las células mantener su resistencia a la apoptosis mediada por citoquinas proinflamatorias. Bajo ciertas circunstancias, eritrocitos maduros pueden sufrir autodestrucción prematura presentando alteraciones celulares similares a las de la apoptosis de una célula nucleada, razón por la que se denominó a este proceso eriptosis. Además de citoquinas, durante los procesos inflamatorios es frecuente encontrar incrementados los niveles de compuestos prooxidantes. Por ello, a continuación se enfocó el trabajo hacia la evaluación de un posible efecto directo de estos agentes sobre eritrocitos maduros. Se estudió el desarrollo de signos de eriptosis en los eritrocitos expuestos a citoquinas proinflamatorias (TNF-α, IL-1β e IFN-γ) y a agentes prooxidantes (NaNO2 y H2O2). Se encontró que éstos pero no las citoquinas indujeron traslocación de fosfatidilserina (PS) en la membrana del eritrocito. Para investigar los posibles mecanismos involucrados en la autodestrucción prematura de los eritrocitos, se analizaron cambios morfológicos y bioquímicos en el glóbulo rojo expuesto a dos condiciones: aumento masivo de calcio intracelular y exposición celular a NaNO2 y H2O2. Además de la externalización de PS, los eritrocitos bajo ambos tratamientos mostraron un incremento del nivel intracelular de calcio, ambas características típicas del desarrollo de eriptosis. Sólo en el modelo de estrés oxidativo se observó, además, el incremento de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la disminución de glutation (GSH). La activación de la proteína PI3K parecería ser relevante en la eriptosis inducida por ambos modelos mientras que la activación de la fosfatasa PTP1B estaría favorecida en el modelo de sobrecarga de calcio. Las modificaciones de proteínas de membrana y los cambios en la morfología celular fueron también signos diferenciales entre ambos tratamientos. La Epo fue capaz de disminuir significativamente la inducción de la alteración en el estado redox celular por NaNO2 y H2O2. En cambio, no fue capaz de inhibir la traslocación de PS en el modelo de incremento de calcio. Las diferencias en los mecanismos involucrados en los dos modelos estudiados podrían explicar la acción diferencial de Epo sobre los eritrocitos inducidos a eriptosis por los diferentes agentes. En base a los resultados obtenidos y a otros trabajos realizados previamente en nuestro laboratorio, se decidió, en el siguiente paso, investigar si compuestos de aluminio pueden actuar como factores proeriptóticos. Experiencias in vivo e in vitro permitieron asociar la sobrecarga de aluminio con anemia. En este trabajo, se estudiaron mecanismos de acción del metal, utilizando un modelo de eritrocitos humanos sometidos a tratamiento prolongado in vitro con cloruro de aluminio. La aparición de eritrocitos con morfología anormal sugirió una interacción del metal con la superficie celular, sustentado por el hallazgo de elevada concentración de Al en la membrana celular. Se demostró que el Al induce signos de eriptosis, como externalización de PS, aumento de calcio intracelular y degradación de banda 3. El hallazgo de un incremento significativo de ROS en conjunto con una disminución de la concentración de GSH mostró un estado de estrés oxidativo. Un punto interesante es que la acción prooxidante del aluminio fue contrarrestada por la Epo. El hecho de que este resultado fuera similar a la prevención del desbalance óxido-reducción por la acción del antioxidante N-acetilcisteina (NAC), sugiere un rol antioxidante de la Epo. El efecto antieriptótico de la Epo podría contribuir a enriquecer el conocimiento acerca del rol fisiológico de esta hormona sobre células eritroides. Independientemente de cuál sea su mecanismo antioxidante, el efecto de Epo demostrado en este modelo de exposición a aluminio, así como en el modelo de estrés oxidativo, nos permite sugerir potenciales beneficios del tratamiento con la hormona en pacientes con anemia asociada a patologías con un ambiente redox alterado. |
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Nesse, Alcira B. Vota, Daiana Marina |
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I28-R145-tesis_n5260_Vota_oai2023-04-26 Nesse, Alcira B. Vota, Daiana Marina 2012 Los procesos inflamatorios, frecuentemente asociados a anemia de enfermedades crónicas, podrían cumplir un rol en la inhibición de la eritropoyesis. La existencia de señales intracelulares comunes entre los procesos que regulan la eritropoyesis y la respuesta inflamatoria sugiere que la desregulación de un sistema podría explicar la disminución de la función del otro. Por otro lado, un daño directo sobre los eritrocitos maduros en circulación, causado por factores presentes en dichos procesos, podría contribuir también al desarrollo de anemia. Teniendo en cuenta que la identificación de factores que pueden afectar la sensibilidad de células eritroides a las diferentes señales recibidas permitiría conocer la interferencia de la inflamación en la eritropoyesis, se planteó como primer objetivo, dilucidar la interrelación entre diferenciación eritroide y apoptosis. Se observó una mayor sensibilidad de la línea eritroleucémica humana K562 a la acción proapoptótica de citoquinas proinflamatorias, como TNF-α e IL-1β, cuando las células se encontraban en etapa de diferenciación eritroide. El estudio de los mecanismos involucrados permitió sugerir, por primera vez, una posible explicación del efecto de TNF-α e IL-1β basada en la disminución de los niveles de la proteína antiapoptótica c-FLIP observada durante la diferenciación con hemina. Más aún, el tratamiento previo con el factor de crecimiento eritropoyetina (Epo) de las células inducidas a diferenciación eritroide las protegió de la acción proapoptótica a la vez que se detectó la modulación positiva de c-FLIP. La Epo contrarrestaría los cambios en las vías de señalización producidos durante el proceso de diferenciación eritroide permitiendo a las células mantener su resistencia a la apoptosis mediada por citoquinas proinflamatorias. Bajo ciertas circunstancias, eritrocitos maduros pueden sufrir autodestrucción prematura presentando alteraciones celulares similares a las de la apoptosis de una célula nucleada, razón por la que se denominó a este proceso eriptosis. Además de citoquinas, durante los procesos inflamatorios es frecuente encontrar incrementados los niveles de compuestos prooxidantes. Por ello, a continuación se enfocó el trabajo hacia la evaluación de un posible efecto directo de estos agentes sobre eritrocitos maduros. Se estudió el desarrollo de signos de eriptosis en los eritrocitos expuestos a citoquinas proinflamatorias (TNF-α, IL-1β e IFN-γ) y a agentes prooxidantes (NaNO2 y H2O2). Se encontró que éstos pero no las citoquinas indujeron traslocación de fosfatidilserina (PS) en la membrana del eritrocito. Para investigar los posibles mecanismos involucrados en la autodestrucción prematura de los eritrocitos, se analizaron cambios morfológicos y bioquímicos en el glóbulo rojo expuesto a dos condiciones: aumento masivo de calcio intracelular y exposición celular a NaNO2 y H2O2. Además de la externalización de PS, los eritrocitos bajo ambos tratamientos mostraron un incremento del nivel intracelular de calcio, ambas características típicas del desarrollo de eriptosis. Sólo en el modelo de estrés oxidativo se observó, además, el incremento de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la disminución de glutation (GSH). La activación de la proteína PI3K parecería ser relevante en la eriptosis inducida por ambos modelos mientras que la activación de la fosfatasa PTP1B estaría favorecida en el modelo de sobrecarga de calcio. Las modificaciones de proteínas de membrana y los cambios en la morfología celular fueron también signos diferenciales entre ambos tratamientos. La Epo fue capaz de disminuir significativamente la inducción de la alteración en el estado redox celular por NaNO2 y H2O2. En cambio, no fue capaz de inhibir la traslocación de PS en el modelo de incremento de calcio. Las diferencias en los mecanismos involucrados en los dos modelos estudiados podrían explicar la acción diferencial de Epo sobre los eritrocitos inducidos a eriptosis por los diferentes agentes. En base a los resultados obtenidos y a otros trabajos realizados previamente en nuestro laboratorio, se decidió, en el siguiente paso, investigar si compuestos de aluminio pueden actuar como factores proeriptóticos. Experiencias in vivo e in vitro permitieron asociar la sobrecarga de aluminio con anemia. En este trabajo, se estudiaron mecanismos de acción del metal, utilizando un modelo de eritrocitos humanos sometidos a tratamiento prolongado in vitro con cloruro de aluminio. La aparición de eritrocitos con morfología anormal sugirió una interacción del metal con la superficie celular, sustentado por el hallazgo de elevada concentración de Al en la membrana celular. Se demostró que el Al induce signos de eriptosis, como externalización de PS, aumento de calcio intracelular y degradación de banda 3. El hallazgo de un incremento significativo de ROS en conjunto con una disminución de la concentración de GSH mostró un estado de estrés oxidativo. Un punto interesante es que la acción prooxidante del aluminio fue contrarrestada por la Epo. El hecho de que este resultado fuera similar a la prevención del desbalance óxido-reducción por la acción del antioxidante N-acetilcisteina (NAC), sugiere un rol antioxidante de la Epo. El efecto antieriptótico de la Epo podría contribuir a enriquecer el conocimiento acerca del rol fisiológico de esta hormona sobre células eritroides. Independientemente de cuál sea su mecanismo antioxidante, el efecto de Epo demostrado en este modelo de exposición a aluminio, así como en el modelo de estrés oxidativo, nos permite sugerir potenciales beneficios del tratamiento con la hormona en pacientes con anemia asociada a patologías con un ambiente redox alterado. The first part of this study focused on the modulation of factors that would affect the sensitivity of erythroid differentiated cells to proinflammatory citokines, such as TNF-α and IL- 1β. The tumor necrosis factor alpha (TNF-α) affects a wide range of biological activities, such as cell proliferation and apoptosis. Cell life or death responses to this cytokine might depend on cell condition. Therefore, it was interesting to study whether erythroid differentiation may affect erythroid progenitors to apoptosis induced by proinflammatory cytokines. Hemin-differentiated K562 cells showed higher sensitivity to TNF-induced apoptosis than undifferentiated cells. At the same time, hemin-induced erythroid differentiation reduced c- FLIP expression. However, this negative effect was prevented by previous treatment with erythropoietin, which allowed the cell line to maintain c-FLIP levels. The results suggest that erythroid differentiation might deregulate the balance between growth promotion and death signals induced by TNF-α, depending on cell type and environmental conditions. The role of c-FLIP seemed to be critical in the protection of erythroid differentiated cells from apoptosis or in the determination of their sensitivity to TNF-mediated programmed cell death. Epo, which for the first time was found to be involved in the prevention of c-FLIP downregulation, proved to have an antiapoptotic effect against the proinflammatory factor. The identification of signals related to cell life/death switching would have significant implications in the control of proliferative diseases, and would contribute to the understanding of mechanisms underlying the anemia associated to inflammatory processes. Proinflammatory factors may not only affect the erythropoiesis process but also cause direct injury upon mature erythrocytes. Eryptosis is a process by which red blood cells can undergo self-destruction sharing several features with apoptosis. Since premature programmed erythrocyte death may be induced by different agents, in this work mechanisms involved in two eryptotic models (oxidative stress and cell calcium overload) were compared. Phosphatidylserine (PS) translocation and increased calcium content were common signs observed in erythrocytes exposed to sodium nitrite plus hydrogen peroxide or calcium ionophore A23187, while increased reactive oxygen species (ROS) and decreased reduced gluthation (GSH) levels were detected in the oxidative model. Protein kinase activation seemed to be an outstanding feature in eryptosis induced by oxidative stress whereas phosphatase activation was favored in the calcium overload model. Cell morphology and membrane protein alterations were also differential signs between both models. Erythropoietin was able to prevent cell oxidative unbalance, thus blunting PS translocation. However, the hormone favored intracellular calcium influx which could be the reason why it could not completely counteract the induction of eryptosis. Instead, erythropoietin was unable to inhibit PS externalization in the increased calcium model. The different mechanisms involved in the eryptotic models may explain the differential action of erythropoietin upon erythrocytes induced to eryptosis by different agents. Previous works developed in our laboratory suggested that aluminum compounds could be proeryptotic agents. The widespread use of aluminum provides easy exposure of humans to the metal and its accumulation remains a potential problem. In vivo and in vitro assays have associated Al overload with anemia and erythrocyte morphological and biochemical changes. To better understand the mechanisms by which aluminum affects human erythrocytes, these cells were exposed to long-term treatment with the metal using an in vitro model developed in our laboratory that mimic in vivo effects. The appearance of erythrocytes with abnormal shapes suggested metal interaction with cell surface, supported by the fact that high amounts of aluminum were found attached to cell membrane. Long-term incubation of human erythrocytes with Al induced signs of premature erythrocyte death (eryptosis), such as phosphatidylserine externalization, increased intracellular calcium, and band 3 degradation. Signs of oxidative stress, such as significant increase in ROS in parallel with decrease in the amount of GSH, were also observed. Interestingly, Epo protected erythrocytes from the prooxidative action of aluminum. Since this result was similar to that of the antioxidant N-acetylcysteine, it can be suggested an antioxidant ability of Epo. In conclusion, results provide evidence that chronic aluminum exposure may lead to biochemical and morphological alterations similar to those shown in eryptosis induced by oxidant compounds in human erythrocytes. The antieryptotic effect of Epo may contribute to enhance the knowledge of its physiological role on erythroid cells. Irrespective of the mechanism involved in its antioxidant action, this property of Epo shown in this model of aluminum exposure, let us suggest additional benefits of the Epo treatment in patients with anemia associated to altered redox environment. Fil: Vota, Daiana Marina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5260_Vota spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar ERITROCITOS ANEMIA ERIPTOSIS ESTRES OXIDATIVO ERITROPOYETINA CALCIO INTRACELULAR CITOQUINAS PROINFLAMATORIAS ALUMINIO ERYTHROCYTES ANEMIA ERYPTOSIS OXIDATIVE STRESS ERYTHROPOIETIN INTRACELLULAR CALCIUM PROINFLAMMATORY CYTOKINES ALUMINUM TOXICITY Eriptosis. 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