Estudio de los componentes del sistema de control de calidad de plegamiento de glicoproteínas en Trypanosoma Cruzi

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El retículo endoplásmico (RE) es el compartimiento celular donde las proteínas que son secretadas o las que residen a lo largo de las vías endo y exocíticas o en la membrana plasmática se pliegan y sufren diversas modificaciones postraduccionales. Para evitar que las proteínas viajen por el camino s...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Conte, Ianina Laura
Otros Autores:	Parodi, Armando J.
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2007
Materias:	RETICULO ENDOPLASMICO N-GLICOSILACION CONTROL DE CALIDAD DE PLEGAMIENTO CHAPERONA UDP-GLC-GLICOPROTEINA GLUCOSILTRANSFERASA CALRETICULINA CALCIO CRUZIPAINA TRYPANOSOMA CRUZI ENDOPLASMIC RETICULUM N-GLYCOSYLATION FOLDING QUALITY CONTROL CHAPERONES UDP-GLC-GLYCOPROTEIN GLUCOSYLTRANSFERASE CALRETICULIN CALCIUM CRUZIPAIN
Acceso en línea:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4021_Conte http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n4021_Conte_oai
Aporte de:	Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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description	El retículo endoplásmico (RE) es el compartimiento celular donde las proteínas que son secretadas o las que residen a lo largo de las vías endo y exocíticas o en la membrana plasmática se pliegan y sufren diversas modificaciones postraduccionales. Para evitar que las proteínas viajen por el camino secretorio sin haber adquirido su conformación nativa, el RE cuenta con sistemas de control de calidad de plegamiento (QC) capaces de distinguir los polipéptidos mal plegados y retenerlos en el RE para que eventualmente se plieguen o terminen siendo degradados. Uno de los principales sistema de QC depende de la presencia de un Nglicano unido a la proteína que se está plegando. El glicano que se transfiere cotraduccionalmente al polipéptido naciente en la mayoría de las células eucariotas tiene la estructura Glc3Man9GlcNAc2. Los dos primeros residuos de glucosa son escindidos por acción de las glucosidasas I y II (GI y GII). El glicano monoglucosilado resultante (G1M9N2) es reconocido por dos lectinas residentes del RE, la calnexina (CNX) y la calreticulina (CRT). Esta interacción se interrumpe cuando la GII remueve la glucosa restante pero puede restituirse gracias a la acción de otra enzima residente del RE, la UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (GT). La GT vuelve a glucosilar sólo a aquellas glicoproteínas que no adquirieron su conformación nativa permitiendo su unión con las lectinas y así aumentando sus posibilidades de plegarse correctamente. En Trypanosoma cruzi se han identificado los tres componentes que forman el sistema de QC de glicoproteínas, GT, GII y CRT (este organismo no posee CNX). En este parásito, a diferencia de lo que ocurre en células de mamíferos, G1M9N2 sólo se forma por acción de la GT, puesto que el glicano transferido a las proteínas nascientes no contiene residuos de glucosa. Dada la gran importancia que diversas glicoproteínas poseen para el ciclo de vida de este parásito, se decidió estudiar si el facilitamiento del plegamiento mediado por CRT de la cruzipaína (CZ), uno de los factores de virulencia de T. cruzi, era esencial para la viabilidad, diferenciación y capacidad infectiva del parásito. Para ello, se identificó y secuenció el gen que codifica para la GT y se obtuvieron T. cruzi mutantes nulos para este gen. Así, se comprobó que la eliminación del sistema de QC de glicoproteínas no afectó el crecimiento de la forma epimastigote del parásito, aunque redujo la capacidad infectiva de la forma trypomastigote. El contenido celular de CZ sólo disminuyó parcialmente (5-20%) a pesar de que en células salvajes más del 90% de estas moléculas interaccionan con CRT. En los T. cruzi carentes de GT no pudo detectarse interacción entre CRT y CZ aún en condiciones muy suaves de inmunoprecipitación sin embargo se verificó un retraso en la llegada de la proteinasa a los lisosomas. Este retraso se debió a la inducción del sistema alternativo de QC basado en BiP/Grp78, cuya interacción con CZ se prolongó. Estos resultados ponen de manifiesto la gran plasticidad de la maquinaria de plegamiento del RE, la cual le permite al párasito sobreponerse a la falta del sistema de QC específico para glicoproteínas. Por otra parte, además de su función como chaperona, CRT es la principal proteína de unión de calcio en el RE. Dado que el nivel de calcio del RE fluctúa de forma considerable se estudió la relación entre ambas funciones de la CRT. La afinidad de CRT por G1M9N2 determinada por equilibrio de diálisis y por anisotropía de fluorescencia no se afectó con modificación de la concentración de calcio presente en el medio. La unión de CRT a neoglicoproteínas que presentan una conformación nativa o de tipo glóbulo fundido también fue independiente de la concentración del ión. En este mismo sentido, se comprobó que el calcio y G1M9N2 estabilizan a CRT frente a la desnaturalización térmica o inducida por urea de manera independiente y aditiva. Además, la capacidad de CRT de inhibir la agregación de IgY desnaturalizada tampoco se modificó al variar los niveles de calcio. En una aproximación in vivo, se observó que al disminuir los niveles de calcio del RE de T. cruzi no se altera la unión entre CRT y CZ. Estas observaciones demuestran que las funciones de chaperona y de unión de calcio de CRT son mutuamente independientes. Por último, se observó que la variación de los niveles de calcio del RE afectaba la localización subcelular de CRT, provocando un aumento de la concentración de esta en el citosol.
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spelling	I28-R145-tesis_n4021_Conte_oai2023-08-03 Parodi, Armando J. Conte, Ianina Laura 2007 El retículo endoplásmico (RE) es el compartimiento celular donde las proteínas que son secretadas o las que residen a lo largo de las vías endo y exocíticas o en la membrana plasmática se pliegan y sufren diversas modificaciones postraduccionales. Para evitar que las proteínas viajen por el camino secretorio sin haber adquirido su conformación nativa, el RE cuenta con sistemas de control de calidad de plegamiento (QC) capaces de distinguir los polipéptidos mal plegados y retenerlos en el RE para que eventualmente se plieguen o terminen siendo degradados. Uno de los principales sistema de QC depende de la presencia de un Nglicano unido a la proteína que se está plegando. El glicano que se transfiere cotraduccionalmente al polipéptido naciente en la mayoría de las células eucariotas tiene la estructura Glc3Man9GlcNAc2. Los dos primeros residuos de glucosa son escindidos por acción de las glucosidasas I y II (GI y GII). El glicano monoglucosilado resultante (G1M9N2) es reconocido por dos lectinas residentes del RE, la calnexina (CNX) y la calreticulina (CRT). Esta interacción se interrumpe cuando la GII remueve la glucosa restante pero puede restituirse gracias a la acción de otra enzima residente del RE, la UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (GT). La GT vuelve a glucosilar sólo a aquellas glicoproteínas que no adquirieron su conformación nativa permitiendo su unión con las lectinas y así aumentando sus posibilidades de plegarse correctamente. En Trypanosoma cruzi se han identificado los tres componentes que forman el sistema de QC de glicoproteínas, GT, GII y CRT (este organismo no posee CNX). En este parásito, a diferencia de lo que ocurre en células de mamíferos, G1M9N2 sólo se forma por acción de la GT, puesto que el glicano transferido a las proteínas nascientes no contiene residuos de glucosa. Dada la gran importancia que diversas glicoproteínas poseen para el ciclo de vida de este parásito, se decidió estudiar si el facilitamiento del plegamiento mediado por CRT de la cruzipaína (CZ), uno de los factores de virulencia de T. cruzi, era esencial para la viabilidad, diferenciación y capacidad infectiva del parásito. Para ello, se identificó y secuenció el gen que codifica para la GT y se obtuvieron T. cruzi mutantes nulos para este gen. Así, se comprobó que la eliminación del sistema de QC de glicoproteínas no afectó el crecimiento de la forma epimastigote del parásito, aunque redujo la capacidad infectiva de la forma trypomastigote. El contenido celular de CZ sólo disminuyó parcialmente (5-20%) a pesar de que en células salvajes más del 90% de estas moléculas interaccionan con CRT. En los T. cruzi carentes de GT no pudo detectarse interacción entre CRT y CZ aún en condiciones muy suaves de inmunoprecipitación sin embargo se verificó un retraso en la llegada de la proteinasa a los lisosomas. Este retraso se debió a la inducción del sistema alternativo de QC basado en BiP/Grp78, cuya interacción con CZ se prolongó. Estos resultados ponen de manifiesto la gran plasticidad de la maquinaria de plegamiento del RE, la cual le permite al párasito sobreponerse a la falta del sistema de QC específico para glicoproteínas. Por otra parte, además de su función como chaperona, CRT es la principal proteína de unión de calcio en el RE. Dado que el nivel de calcio del RE fluctúa de forma considerable se estudió la relación entre ambas funciones de la CRT. La afinidad de CRT por G1M9N2 determinada por equilibrio de diálisis y por anisotropía de fluorescencia no se afectó con modificación de la concentración de calcio presente en el medio. La unión de CRT a neoglicoproteínas que presentan una conformación nativa o de tipo glóbulo fundido también fue independiente de la concentración del ión. En este mismo sentido, se comprobó que el calcio y G1M9N2 estabilizan a CRT frente a la desnaturalización térmica o inducida por urea de manera independiente y aditiva. Además, la capacidad de CRT de inhibir la agregación de IgY desnaturalizada tampoco se modificó al variar los niveles de calcio. En una aproximación in vivo, se observó que al disminuir los niveles de calcio del RE de T. cruzi no se altera la unión entre CRT y CZ. Estas observaciones demuestran que las funciones de chaperona y de unión de calcio de CRT son mutuamente independientes. Por último, se observó que la variación de los niveles de calcio del RE afectaba la localización subcelular de CRT, provocando un aumento de la concentración de esta en el citosol. The endoplasmic reticulum (ER) is the site of folding for proteins destined for compartments of the secretory and endocytic pathways, the plasma membrane and secretion. Only native proteins are released from the ER. Folding intermediates, orphan subunits of oligomeric complexes, and misfolded polypeptides are retained in the ER and eventually forwarded to degradation in a complex series of events denominated Quality Control (QC). N-glycans are directly involved in QC. Nglycosylation occurs in most eukaryotic cells by addition of a preassembled core glycan (Glc3Man9GlcNAc2) to nascent polypeptides emerging into the ER lumen. Rapid trimming of the two outermost glucose residues by ER-resident enzymes glucosidases I (GI) and glucosidase II (GII) generates a monoglucosilated protein bound N-glycan (G1M9N2) which is recognized by the ER lectins calnexin (CNX) and calreticulin (CRT). Release from CNX/CRT is followed by GII cleavage of the innermost glucose residue. The folding sensor UDP-glucose:glycoprotein glycosyltransferase (GT) adds back a terminal glucose to promote re-association of non-native polypeptides with the lectins, thus prolonging their retention in the ER folding environment. The three components involved in QC of glycoprotein folding, i.e. GT, GII and CRT, have been described in Trypanosoma cruzi (this parasite lacks CNX). However, contrary to what happens in most eukaryotic cells, in trypanosomatid protozoa G1M9N2 is exclusively formed by GT action because unglucosylated Nglycans are transfered to nascent polypeptides. The gene coding for GT was identified and sequenced. Even though several of this parasite glycoproteins have been identified as essential components of differentiation and mammalian cell invasion processes, disruption of both GT-encoding alleles did not affect cell growth rate of epimastigote form parasites and partially affected differentiation and mammalian cell invasion of the trypomastigote form. The cellular content of one of the already identified T. cruzi glycoprotein virulence factors (cruzipain, CZ, a lysosomal proteinase) only showed a partial (5-20%) decrease in GT null mutants in spite of the fact that >90% of all CZ molecules interacted with CRT during their folding process in wild-type cells. Although extremely mild cell lysis and immunoprecipitation procedures were used, no CRT-CZ interaction was detected in GT-null mutants, but secretion of the proteinase was nevertheless delayed because of a lengthened interaction with BiP/Grp78 probably caused by the detected induction of this chaperone in GT null mutants. This result provides a rationale for the absence of a more drastic consequence of GT absence. It was concluded that T. cruzi ER folding machinery presents an exquisite plasticity that allows the parasite to surmount the absence of the glycoprotein-specific folding facilitation mechanism. Besides being a chaperone, CRT is one of the main calcium buffers in the cell. Here, we study the interplay between these roles of CRT. The affinity of CRT for G1M9N2 measured in solution by equilibrium dialysis or fluorescence anisotropy was not affected by the absence of calcium. Binding of CRT to monoglucosylated neoglycoproteins displaying either native or molten globule-like conformations was also independent of calcium concentrations. Moreover, calcium and G1M9N2 stabilized CRT structure in an apparent additive, independent manner when the protein was subjected to thermal or urea-induced denaturation. In addition, the ability of CRT to decrease the level of aggregation of a chemically denatured monoglycosylated and nonglycosylated IgY was also independent of calcium level. From an in vivo point of view, a decrease in ER calcium concentration in T. cruzi cells did not alter CRT-CZ binding. Thus, chaperone and calcium binding activities of CRT are independent. On the other hand, changes in ER calcium levels influenced CRT location, leading to an increase in CRT in the citosol of T. cruzi cells. Fil: Conte, Ianina Laura. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4021_Conte spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar RETICULO ENDOPLASMICO N-GLICOSILACION CONTROL DE CALIDAD DE PLEGAMIENTO CHAPERONA UDP-GLC-GLICOPROTEINA GLUCOSILTRANSFERASA CALRETICULINA CALCIO CRUZIPAINA TRYPANOSOMA CRUZI ENDOPLASMIC RETICULUM N-GLYCOSYLATION FOLDING QUALITY CONTROL CHAPERONES UDP-GLC-GLYCOPROTEIN GLUCOSYLTRANSFERASE CALRETICULIN CALCIUM CRUZIPAIN TRYPANOSOMA CRUZI Estudio de los componentes del sistema de control de calidad de plegamiento de glicoproteínas en Trypanosoma Cruzi On the components of the glycoprotein folding quality control system in Trypanosoma Cruzi info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n4021_Conte_oai

Estudio de los componentes del sistema de control de calidad de plegamiento de glicoproteínas en Trypanosoma Cruzi

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