Esferoides multicelulares como modelo tumoral in vitro para el estudio de la expresión de transgenes y la terapia génica
El cultivo celular tridimensional en esferoides es un modelo mucho más realista que el cultivo en monocapas para estudiar el comportamiento de los tumores y su respuesta a distintas terapias. Los esferoides expresaron transgenes lipofectados en forma transitoria y dirigidos por el promotor CMVie (pr...
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Publicado: |
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
2006
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El cultivo celular tridimensional en esferoides es un modelo mucho más realista que el cultivo en monocapas para estudiar el comportamiento de los tumores y su respuesta a distintas terapias. Los esferoides expresaron transgenes lipofectados en forma transitoria y dirigidos por el promotor CMVie (promotor inmediato-temprano del Cito Megalo Virus)(plásmido pCMVβ) con mayor eficiencia que las monocapas, y dicha expresión persistió durante más de 75 días, siendo en dicho momento similar a la de monocapas no repicadas de 8 días. Este aumento en la expresión se revirtió cuando las células formaron monocapas, y no fue debido a la integración de los vectores, que persistieron como episomas. El agregado de las secuencias EBNA-1 y oriP del virus Epstein-Barr al pCMVβ aumentó la expresión del transgén en células humanas HEp-2. El promotor CMVie produjo los mayores niveles de expresión en todas las líneas celulares evaluadas. Su deleción parcial (325 bp del extremo 5´) prácticamente anuló su actividad, la que fue parcialmente restaurada por el agregado de cortas secuencias consenso. Los esferoides resultaron menos sensibles al sistema gen suicida/prodroga HSVtk/GCV que las monocapas correspondientes, y presentaron un menor efecto bystander. Este fenómeno no fue consecuencia de una baja penetración del GCV sino que involucró otros mecanismos. Sin embargo, los esferoides transfectados con HSVtk fueron significativamente más sensibles al GCV que sus controles transfectados con βgal, lo que sustenta el uso de esta estrategia in vivo. |
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I28-R145-tesis_n3971_Casais_oai2023-08-03 Finocchiaro, Liliana M. E. Casais, Cecilia Carolina 2006 El cultivo celular tridimensional en esferoides es un modelo mucho más realista que el cultivo en monocapas para estudiar el comportamiento de los tumores y su respuesta a distintas terapias. Los esferoides expresaron transgenes lipofectados en forma transitoria y dirigidos por el promotor CMVie (promotor inmediato-temprano del Cito Megalo Virus)(plásmido pCMVβ) con mayor eficiencia que las monocapas, y dicha expresión persistió durante más de 75 días, siendo en dicho momento similar a la de monocapas no repicadas de 8 días. Este aumento en la expresión se revirtió cuando las células formaron monocapas, y no fue debido a la integración de los vectores, que persistieron como episomas. El agregado de las secuencias EBNA-1 y oriP del virus Epstein-Barr al pCMVβ aumentó la expresión del transgén en células humanas HEp-2. El promotor CMVie produjo los mayores niveles de expresión en todas las líneas celulares evaluadas. Su deleción parcial (325 bp del extremo 5´) prácticamente anuló su actividad, la que fue parcialmente restaurada por el agregado de cortas secuencias consenso. Los esferoides resultaron menos sensibles al sistema gen suicida/prodroga HSVtk/GCV que las monocapas correspondientes, y presentaron un menor efecto bystander. Este fenómeno no fue consecuencia de una baja penetración del GCV sino que involucró otros mecanismos. Sin embargo, los esferoides transfectados con HSVtk fueron significativamente más sensibles al GCV que sus controles transfectados con βgal, lo que sustenta el uso de esta estrategia in vivo. The three-dimensional cell culture in spheroids is a much more realistic model than monolayer cultures to study tumor behavior and its responsiveness to different therapies. Spheroids expressed transiently lipofected CMVie (immediate-early Cito Megalo Virus promoter)-directed transgenes much more efficiently than monolayers, and this expression lasted for more than 75 days, being at this moment similar to non-replated monolayer expression at 8 days. This enhancement in expression was reverted when cells formed monolayers, and was not due to integration of vectors, which persisted as episomes. The addition of EBNA-1 and oriP sequences from Epstein-Barr virus increased transgene expression in human HEp-2 cells. The CMVie promoter produced the higher expression levels in all cell lines tested. Its partial deletion (325 bp from the 5' edge) abolished most of its activity, which was partially restored by the addition of short consensus sequences. Spheroids resulted less sensitive to the suicide gene/prodrug HSVtk/GCV system than the corresponding monolayers, and they showed a lower bystander effect. This phenomenon was not a consequence of a low GCV penetration but involved another mechanisms. However, HSVtk-transfected spheroids were significatively more sensitive to GCV than their βgal-transfected controls, a fact that supports the utilization of this approach in vivo. Fil: Casais, Cecilia Carolina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3971_Casais spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar ESFEROIDES MULTICELULARES TUMORALES TERAPIA GENICA VECTORES NO VIRALES LIPOFECCION EXPRESION DE TRANSGENES PERSISTENCIA DE EXPRESION SISTEMA HSVTKLGCV MULTICELLULAR TUMOR SPHEROIDS GENE THERAPY NON-VIRAL VECTORS LIPOFECTION TRANSGENE EXPRESSION PERSISTENCE OF EXPRESSION HSVTKLGCV SYSTEM Esferoides multicelulares como modelo tumoral in vitro para el estudio de la expresión de transgenes y la terapia génica Multicellular spheroids as an in vitro tumor model to study transgene expression and gene therapy info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n3971_Casais_oai |