Mecanismos de control de la acidificación tubular proximal : 1)Regulación parácrina de la función tubular por el endotelio capilar 2) Interacción entre el sistema renina-angiotensina y el óxido nítrico (NO)

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El objetivo del presente trabajo fue analizar diferentes mecanismos que modulan laacidificación tubular proximal utilizando dos estrategias: a) la modificación aguda de laviscosidad del fluido peritubular y b) la inhibición crónica del sistema renina-angiotensina (SRA). Se ha informado que el óxido...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Díaz Sylvester, Paula L.
Otros Autores:	Amorena, Carlos E.
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2003
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3674_DiazSylvester http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n3674_DiazSylvester_oai
Aporte de:	Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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La viscosidad de la SPP se incrementó por elagregado de dextran neutro (P.M.: 300.000-400.000). Dado que aumentos en el shear tressinducen la liberación de ATP, se evaluó el efecto de ATP (10^-5 M) agregado a la SPP deviscosidad normal. La viscosidad aumentada indujo un aumento en el flujo de H+ (JH+)(85%y 97% con aumentos en η de 30% y 50% respectivamente, sobre el control). Este efecto fueabolido cuando se agregó el inhibidor de la síntesis de NO Nω-nitro-L-arginina (L-NNA, 10^-4 M) o los antagonistas de receptores purinérgicos suramin (10^-4 M) y reactive blue 2 (RB2, 3x10^-5 M). La adición de L-arginina 5x10^-3 M, a la SPP de alta viscosidad conteniendo L-NNA,recuperó el efecto estimulatorio de la alta viscosidad. El ATP indujo un aumento del 80% en JH+ y este efecto se bloqueó con L-NNA. Nuestros resultados sugieren que cambiosen η (y consecuentemente en el shear stress) modularían la secreción proximal de de H+, almenos en parte, a través de la liberación de NO dependiente de ATP desde las célulasendoteliales de los capilares peritubulares. Los cambios en la viscosidad de la sangre quecircula por la arteriola eferente y los capilares peritubulares, debidos a la filtraciónglomerular, podrían participar en el control normal de la reabsorción tubular (es decir, en elcontrol del balance glomérulo-tubular), además de los ya descriptos factores fisicos (presionesoncótica e hidrostática) La segunda parte de este trabajo se centró en el estudio del efecto de la inhibición crónicadel SRA sobre la acidificación tubular proximal y de los mecanismos involucrados en tal efecto, haciendo énfasis en la interacción del SRA con el NO. Se utilizó un protocolo deadministración crónica de enalapril, un inhibidor de la enzima convertidora de laangiotensina, y losartan, un antagonista de los receptores de tipo ATI para la angiotensina II (10 mg*Kg^-1xdía^-1 durante tres meses, en la bebida). Mediante experimentos de micropunturase determinó que el JH+aumentó 52% en los tratados con losartan y 87% en los animalestratados crónicamente con enalapril, comparados con animales sin tratamiento. La inhibiciónde la síntesis de NO con L-NNA (15 mg/kg, IV) durante el experimento, previno los efectosestimulatorios de losartan y enalapril sobre JH+.La actividad de síntesis de NO (NOS) sedeterminó mediante el dosaje de [14C]-L-citrulina formada a partir de [14C]-L-arginina. Loshomogenatos de corteza renal de animales tratados crónicamente con losartan y enalaprilpresentaron un aumento en la actividad de NOS de 41% y 46% con respecto al control,respectivamente. Estos resultados sugieren que el efecto estimulatorio del enalapril y dellosartan sobre la secreción proximal de H+ podría estar mediado, al menos en parte, por NO. La inhibición crónica del SRA no modificó los niveles de la isoforma inducible de la sintetasade óxido nítrico (iNOS), indujo un aumento en la abundancia de la isoforma endotelial (eNOS) y una disminución en la expresión de la isoforma neuronal (nNOS). Este resultadosugiere que las diferencias en la actividad de NOS observadas entre los grupos experimentalespodrían deberse, en parte, a la variación en el nivel de expresión de la eNOS. Por otra parte, lainhibición crónica del SRA, indujo un aumento en los contenidos de NHE-3 y la H+-ATPasaen membrana apical, analizados por westem blot en vesículas aisladas de ribete en cepillo. Estos resultados sugieren que el efecto estimulatorio de esas drogas sobre la acidificaciónproximal podría depender, al menos en parte, de los niveles de expresión de dichostransportadores en membrana apical. Por lo tanto, la inhibición crónica del SRA afectaría a laacidificación proximal mediante al menos dos mecanismos: un aumento en la disponibilidadde los transportadores involucrados y la estimulación del intercambio Na+/H+ apicaldependiente de la síntesis de NO. En resumen, este trabajo muestra que los mecanismos de control de la acidificación tubularproximal en respuesta al shear stress peritubular y a la inhibición crónica del SRA involucranla síntesis de NO, probablemente en el endotelio de los capilares peritubulares y/o de laarteriola eferente, y la interacción paracrina endotelio — epitelio.
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Se midieron los cambios en el pH de unagota de Ringer HNaPO4- 20mM (pHt=0:7,4) ubicada en el lumen del TCP por medio de unmicroelectrodo de resina sensible a H+. La viscosidad de la SPP se incrementó por elagregado de dextran neutro (P.M.: 300.000-400.000). Dado que aumentos en el shear tressinducen la liberación de ATP, se evaluó el efecto de ATP (10^-5 M) agregado a la SPP deviscosidad normal. La viscosidad aumentada indujo un aumento en el flujo de H+ (JH+)(85%y 97% con aumentos en η de 30% y 50% respectivamente, sobre el control). Este efecto fueabolido cuando se agregó el inhibidor de la síntesis de NO Nω-nitro-L-arginina (L-NNA, 10^-4 M) o los antagonistas de receptores purinérgicos suramin (10^-4 M) y reactive blue 2 (RB2, 3x10^-5 M). La adición de L-arginina 5x10^-3 M, a la SPP de alta viscosidad conteniendo L-NNA,recuperó el efecto estimulatorio de la alta viscosidad. El ATP indujo un aumento del 80% en JH+ y este efecto se bloqueó con L-NNA. Nuestros resultados sugieren que cambiosen η (y consecuentemente en el shear stress) modularían la secreción proximal de de H+, almenos en parte, a través de la liberación de NO dependiente de ATP desde las célulasendoteliales de los capilares peritubulares. Los cambios en la viscosidad de la sangre quecircula por la arteriola eferente y los capilares peritubulares, debidos a la filtraciónglomerular, podrían participar en el control normal de la reabsorción tubular (es decir, en elcontrol del balance glomérulo-tubular), además de los ya descriptos factores fisicos (presionesoncótica e hidrostática) La segunda parte de este trabajo se centró en el estudio del efecto de la inhibición crónicadel SRA sobre la acidificación tubular proximal y de los mecanismos involucrados en tal efecto, haciendo énfasis en la interacción del SRA con el NO. Se utilizó un protocolo deadministración crónica de enalapril, un inhibidor de la enzima convertidora de laangiotensina, y losartan, un antagonista de los receptores de tipo ATI para la angiotensina II (10 mg*Kg^-1xdía^-1 durante tres meses, en la bebida). Mediante experimentos de micropunturase determinó que el JH+aumentó 52% en los tratados con losartan y 87% en los animalestratados crónicamente con enalapril, comparados con animales sin tratamiento. La inhibiciónde la síntesis de NO con L-NNA (15 mg/kg, IV) durante el experimento, previno los efectosestimulatorios de losartan y enalapril sobre JH+.La actividad de síntesis de NO (NOS) sedeterminó mediante el dosaje de [14C]-L-citrulina formada a partir de [14C]-L-arginina. Loshomogenatos de corteza renal de animales tratados crónicamente con losartan y enalaprilpresentaron un aumento en la actividad de NOS de 41% y 46% con respecto al control,respectivamente. Estos resultados sugieren que el efecto estimulatorio del enalapril y dellosartan sobre la secreción proximal de H+ podría estar mediado, al menos en parte, por NO. La inhibición crónica del SRA no modificó los niveles de la isoforma inducible de la sintetasade óxido nítrico (iNOS), indujo un aumento en la abundancia de la isoforma endotelial (eNOS) y una disminución en la expresión de la isoforma neuronal (nNOS). Este resultadosugiere que las diferencias en la actividad de NOS observadas entre los grupos experimentalespodrían deberse, en parte, a la variación en el nivel de expresión de la eNOS. Por otra parte, lainhibición crónica del SRA, indujo un aumento en los contenidos de NHE-3 y la H+-ATPasaen membrana apical, analizados por westem blot en vesículas aisladas de ribete en cepillo. Estos resultados sugieren que el efecto estimulatorio de esas drogas sobre la acidificaciónproximal podría depender, al menos en parte, de los niveles de expresión de dichostransportadores en membrana apical. Por lo tanto, la inhibición crónica del SRA afectaría a laacidificación proximal mediante al menos dos mecanismos: un aumento en la disponibilidadde los transportadores involucrados y la estimulación del intercambio Na+/H+ apicaldependiente de la síntesis de NO. En resumen, este trabajo muestra que los mecanismos de control de la acidificación tubularproximal en respuesta al shear stress peritubular y a la inhibición crónica del SRA involucranla síntesis de NO, probablemente en el endotelio de los capilares peritubulares y/o de laarteriola eferente, y la interacción paracrina endotelio — epitelio. The aim of this work was to study different mechanisms that modulate proximal tubuleacidification using two strategies: a) the acute modification of peritubular capillaries fluidviscosity and b) the chronic inhibition of renin angiotensin system (RAS). It has been reported that nitric oxide (NO) stimulates proximal tubule acidification. Sinceshear stress is a strong agonist for NO release, and the degree of shear stress is proportional tofluid viscosity (η), we evaluated the effects of increasing η in peritubular capillary perfusates (PCP; 20 mM HNaPO42- Ringer, pH 7.4) on proximal convoluted tubule (PCT) acidification. Micropuncture experiments were performed with simultaneous luminal and peritubularperfusion. Changes in pH of a 20 mM HNaPO42- Ringer (pHFO 7.4) droplet placed in PCTlumen were measured with H+-sensitive microelectrodes. Viscosity was increased by addingneutral dextran (molecular wt 300,000-400,000) to the PCP. Since increases in shear stressinduce ATP release, the effect of 10^-5 M ATP added to normal-η PCP was evaluated. High ηincreased H+ flux (JH+)(85 and 97% when η was increased 20 and 30%, respectively, abovethe control value). This increase was abolished by adding the NO synthesis inhibitor Nω-nitro-L-arginine (L-NNA; 10^-4 M) or the purinoreceptor antagonists suramin (10^-4 M) and reactiveblue 2 (3x10^-5 M). Addition of 5x10^-3 M L-arginine to the peritubular perfusate overcame theinhibitory effect of L-NNA on high-η-induced increase in JH+. ATP increased JH+(80%), andthis effect was blocked by L-NNA. These results suggest that changes in η (and consequentlyin shear stress) can modulate proximal JH+, at least in part, through ATP-dependent NOrelease from the endothelial cells of the peritubular capillaries. The changes in η ofpostglomerular blood due to glomerular filtration, could participate in the regulation oftubular reabsorption (i.e. in the control of glomerular-tubular balance) and operate in parallelwith the already described physic factors (capillary oncotic and hydrostatic pressures). The second part of this work is aimed to study the effect of chronic RAS inhibition onproximal tubule acidification and the mechanisms involved in such effect, including theinteraction between RAS and NO. We performed a protocol of chronic oral administration ofenalapril, an angiotensin converting enzyme inhibitor and losartan a type AT1 angiotensinreceptor antagonist (10 mgxKg^-1 x day^-1, along 3 months). Proximal H+secretion, compared tocontrol values and assessed by micropuncture experiments, was increased 52% and 87% in losartan- and enalapril-treated animals, respectively. NO synthesis inhibition by bolusinjection of L-NNA during micropuncture, abolished the stimulatory effects of chronic RASinhibition. NO synthesis activity was assessed by measurement of conversion of [14C]-arginineto [14C]-citrulline. NOS activity increased in renal cortex homogenates from animalsunder chronic RAS inhibition (41% and 46%, compared to control, losartan and enalaprilrespectively). Our results suggest that the stimulating effect losartan and enalapril onproximal JH+ could be mediated, in part, by NO. Chronic RAS inhibition induced no changesin the levels of the inducible nitric oxide synthase (iNOS), a decrease in neuronal NOS (nNOS) and an increase in endothelial NOS (eNOS), suggesting that the differences in NOSactivity among experimental groups might depend, in part, on eNOS protein synthesis. Inaddition, chronic RAS inhibition increased the abundance of NHE-3 and H+-ATPase in brushborder membrane vesicles. These results suggest that the effects of the drugs used in this workon proximal acidification could depend, in part, on the abundance of transporters for apicalmembrane H+ extrusion. Thus, chronic RAS inhibition would affect proximal acidificationthrough two mechanisms: an increase in the availability of the transporters involved and NOdependent JH+ stimulation. In summary, this work show that proximal tubule acidification mechanisms that involveeffects of NO, probably synthesised in peritubular capillaries and/or efferent arterioleendothelium, on proximal tubule function. Fil: Díaz Sylvester, Paula L.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3674_DiazSylvester spa Universidad de Buenos Aires. 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Mecanismos de control de la acidificación tubular proximal : 1)Regulación parácrina de la función tubular por el endotelio capilar 2) Interacción entre el sistema renina-angiotensina y el óxido nítrico (NO)

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