Metabolismos de alfa y beta-glucanos en bacterias que interaccionan con plantas

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Las bacterias sintetizan y acumulan diferentes polisacáridos de tipo α y β,los cuales cumplen funciones relevantes en la adaptación a los distintosentornos ambientales y en la interacción de las mismas con otrosorganismos. Los estudios que realizamos se refirieron especificamente almetabolismo de lo...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Estrella, María Julia
Otros Autores: Iglesias, Alberto Alvaro
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2003
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3672_Estrella
http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n3672_Estrella_oai
Aporte de:
Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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La cepa B. loti NZP 2309produce una mezcla de glucanos cíclicos con uniones β(1-3), β(1-6), queestán formados por especies neutras, no sustituidas, con DP= 10, 11 y 12,y la especie cíclica mayoritaria esta ramificada, tiene un DP=11 y estáformada por un anillo de 10 residuos de glucosa con un único residuoterminal que forma la rama. La proporción de enlaces glucosidicos quetiene este glucano cíclico es 3:7:1 para las uniones β(1-3), β(1-6)y β(1-3, 6)respectivamente. La comparación de los glucanos cíclicos producidos porlas cepas de B. loti NZP 2309 y B. japonicum USDA 110, sugiere que dichasmoléculas tienen propiedades hidrofóbicas diferenciales y distintacapacidad de unión con flavonoides de leguminosas. Por otra parte, seobservó que ambas cepas de Bradyrhizobium sintetizan in vitro, glucanoscíclicos β(l-3), β(1-6) por mecanismos similares y que dichos glucanosestán estructuralmente relacionados. En B. loti NZP 2309 se identificó unaproteína de membrana interna de 85 kDa que podría estar involucrada enla sintesis de glucanos solubles β(1-3) y β(1-6); insolubles β(1-3) tipolaminarina, o en la sintesis de ambos compuestos. Las moléculassintetizadas in vitro están formadas principalmente por enlaces β(1-3),mientras que las moléculas producidas in vivo tienen mayor proporción deenlaces β(1-6). Nuestros resultados sugieren que la síntesis de glucanoscíclicos β(1-3), β(1-6)en Bradyrhizobium sp podria involucrar la formaciónde un glucano cíclico con uniones β(1-3), al que posteriormente seintroducen uniones β(1-6)por transglicosilación, a través de la proteína NdvC Además, determinamos y comparamos el tipo de glucano quesintetizan y acumulan dos cepas de colección de M. loti, y evaluamos si laestrucutra de los mismos está relacionada con la capacidad que tienendichas cepas para nodular distintas espcecies de Lotus. Se determinó quelas cepas M. loti NZP 2213 y NZP 2037 producen glucanos cíclicos neutrosy sustituidos con residuos aniónicos y uniones β(1-2), los que sonsimilares a los reportados en otros rizobios de crecimiento rápido. Lasintesis de los glucanos de M. loti se realiza a través de una proteínaintermediaria que tiene una masa molecular similar a la proteína de 319kDa reportada en otros rizobios que sintetizan glucanos cíclicos β(1-2).Seestableció que el tipo de glucano producido por las cepas M. loti NZP 2213, NZP 2037 y B. loti NZP 2309 no está relacionado con el rango dehospedante, ya que se determinó que las dos especies de M. loti producenglucanos similares con el mismo tipo de unión y presentan distinto rango de nodulación. Además, se observó que dos cepas con distinto tipo deglucano forman nódulos efectivos en una misma especies de Lotus. Otra parte de la tesis se centró en el metabolismo del glucógeno en bacteriasque interaccionan con plantas. Se clonó y caracterizó un fragmento de ADNgenómico de B. loti que tiene homologia con el genes de la síntesis deglucógeno y que contiene gran parte del gen glgC y el gen glgA completo, quecodifican para las enzimas ADPGlc PPasa y GS, respectivamente. Elfragmento clonado es similar a una región presente en el genoma de B.japonicum, indicando que la organización de los genes estructurales delmetabolismo del glucógeno en el género Bradyrhizobium está conservada y esdiferente a la reportada en otras bacterias. Las secuencias aminoacidicas dela ADPGlc PPasa y GS de B. loti presentan un grado de homologia mayor conlas enzimas de B. japonicum que con otras enzimas homólogas de rizobios. La ADPGlc PPasa de B. loti pertenece al grupo V de ADPGlc PPasas que estánaltamente reguladas ya que se activan por Fru 6P, Fru 1,6 bisP y piruvato. La actividad de esta enzima en nódulos reveló que la ADPGlc PPasa debacteroides de B.japonicum aumenta con la maduración del nódulo, cuandolos mismos todavía tienen actividad reductora de acetileno. Por otra parte, serealizaron experimentos de mutagénesis sitio-dirigida con la ADPGlc PPasade A. tumefaciens, que se tomó como modelo experimental, para determinarel rol que tienen los residuos de arginina que están conservados y ubicadosen la región N-terminal de las ADPGlc PPasas reguladas positivamente por Fru 6P y piruvato. Se determinó que una carga positiva en la posición 32sería necesaria para mantener la afinidad aparente de las ADPGlc PPasasactivadas por hexosas-fosfato y/o piruvato y cualquier modificación dearginina por otro aminoácido que altere el tamaño o la hidrofobicidad, reducela afinidad aparente por Fru 6P. El comportamiento de las mutantes en laposición 33 respecto a los activadores fue diferente, afectándose de maneramás drástica la activación por Fru 6P que la activación por piruvato. Lapresencia de arginina en la posición 33 es muy importante para la activaciónde la ADPGlc PPasa de A. tumefaciens y no podría ser reemplazada por otroaminoácido. La presencia de arginina en la posición 45 es importante para laactivación de la enzima por Fru 6P pero es poco probable que desempeñe unrol directo en la unión de un efector particular, ya que está completamenteconservada entre todas las ADPGlcPPasas bacterianas analizadas.
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La cepa B. loti NZP 2309produce una mezcla de glucanos cíclicos con uniones β(1-3), β(1-6), queestán formados por especies neutras, no sustituidas, con DP= 10, 11 y 12,y la especie cíclica mayoritaria esta ramificada, tiene un DP=11 y estáformada por un anillo de 10 residuos de glucosa con un único residuoterminal que forma la rama. La proporción de enlaces glucosidicos quetiene este glucano cíclico es 3:7:1 para las uniones β(1-3), β(1-6)y β(1-3, 6)respectivamente. La comparación de los glucanos cíclicos producidos porlas cepas de B. loti NZP 2309 y B. japonicum USDA 110, sugiere que dichasmoléculas tienen propiedades hidrofóbicas diferenciales y distintacapacidad de unión con flavonoides de leguminosas. Por otra parte, seobservó que ambas cepas de Bradyrhizobium sintetizan in vitro, glucanoscíclicos β(l-3), β(1-6) por mecanismos similares y que dichos glucanosestán estructuralmente relacionados. En B. loti NZP 2309 se identificó unaproteína de membrana interna de 85 kDa que podría estar involucrada enla sintesis de glucanos solubles β(1-3) y β(1-6); insolubles β(1-3) tipolaminarina, o en la sintesis de ambos compuestos. Las moléculassintetizadas in vitro están formadas principalmente por enlaces β(1-3),mientras que las moléculas producidas in vivo tienen mayor proporción deenlaces β(1-6). Nuestros resultados sugieren que la síntesis de glucanoscíclicos β(1-3), β(1-6)en Bradyrhizobium sp podria involucrar la formaciónde un glucano cíclico con uniones β(1-3), al que posteriormente seintroducen uniones β(1-6)por transglicosilación, a través de la proteína NdvC Además, determinamos y comparamos el tipo de glucano quesintetizan y acumulan dos cepas de colección de M. loti, y evaluamos si laestrucutra de los mismos está relacionada con la capacidad que tienendichas cepas para nodular distintas espcecies de Lotus. Se determinó quelas cepas M. loti NZP 2213 y NZP 2037 producen glucanos cíclicos neutrosy sustituidos con residuos aniónicos y uniones β(1-2), los que sonsimilares a los reportados en otros rizobios de crecimiento rápido. Lasintesis de los glucanos de M. loti se realiza a través de una proteínaintermediaria que tiene una masa molecular similar a la proteína de 319kDa reportada en otros rizobios que sintetizan glucanos cíclicos β(1-2).Seestableció que el tipo de glucano producido por las cepas M. loti NZP 2213, NZP 2037 y B. loti NZP 2309 no está relacionado con el rango dehospedante, ya que se determinó que las dos especies de M. loti producenglucanos similares con el mismo tipo de unión y presentan distinto rango de nodulación. Además, se observó que dos cepas con distinto tipo deglucano forman nódulos efectivos en una misma especies de Lotus. Otra parte de la tesis se centró en el metabolismo del glucógeno en bacteriasque interaccionan con plantas. Se clonó y caracterizó un fragmento de ADNgenómico de B. loti que tiene homologia con el genes de la síntesis deglucógeno y que contiene gran parte del gen glgC y el gen glgA completo, quecodifican para las enzimas ADPGlc PPasa y GS, respectivamente. Elfragmento clonado es similar a una región presente en el genoma de B.japonicum, indicando que la organización de los genes estructurales delmetabolismo del glucógeno en el género Bradyrhizobium está conservada y esdiferente a la reportada en otras bacterias. Las secuencias aminoacidicas dela ADPGlc PPasa y GS de B. loti presentan un grado de homologia mayor conlas enzimas de B. japonicum que con otras enzimas homólogas de rizobios. La ADPGlc PPasa de B. loti pertenece al grupo V de ADPGlc PPasas que estánaltamente reguladas ya que se activan por Fru 6P, Fru 1,6 bisP y piruvato. La actividad de esta enzima en nódulos reveló que la ADPGlc PPasa debacteroides de B.japonicum aumenta con la maduración del nódulo, cuandolos mismos todavía tienen actividad reductora de acetileno. Por otra parte, serealizaron experimentos de mutagénesis sitio-dirigida con la ADPGlc PPasade A. tumefaciens, que se tomó como modelo experimental, para determinarel rol que tienen los residuos de arginina que están conservados y ubicadosen la región N-terminal de las ADPGlc PPasas reguladas positivamente por Fru 6P y piruvato. Se determinó que una carga positiva en la posición 32sería necesaria para mantener la afinidad aparente de las ADPGlc PPasasactivadas por hexosas-fosfato y/o piruvato y cualquier modificación dearginina por otro aminoácido que altere el tamaño o la hidrofobicidad, reducela afinidad aparente por Fru 6P. El comportamiento de las mutantes en laposición 33 respecto a los activadores fue diferente, afectándose de maneramás drástica la activación por Fru 6P que la activación por piruvato. Lapresencia de arginina en la posición 33 es muy importante para la activaciónde la ADPGlc PPasa de A. tumefaciens y no podría ser reemplazada por otroaminoácido. La presencia de arginina en la posición 45 es importante para laactivación de la enzima por Fru 6P pero es poco probable que desempeñe unrol directo en la unión de un efector particular, ya que está completamenteconservada entre todas las ADPGlcPPasas bacterianas analizadas. Fil: Estrella, María Julia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3672_Estrella spa Universidad de Buenos Aires. 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