Rol de los oligosacáridos monoglucosilados en el plegamiento de glicoproteínas en Schizosacchatomyces pombe
El retículo endoplasmático (RE) es el compartimiento de varias modificación post-traduccionalesy plegamiento de proteínas destinadas a secreción, a membrana plasmática o aorganelas del sistema endocítico. Una de las modificaciones post-traduccionales mas frecuentes, la N-glicosilación, está relacion...
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| Formato: | Tesis doctoral publishedVersion |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
2001
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| Materias: | |
| Acceso en línea: | https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3360_DAlessio http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n3360_DAlessio_oai |
| Aporte de: |
| Sumario: | El retículo endoplasmático (RE) es el compartimiento de varias modificación post-traduccionalesy plegamiento de proteínas destinadas a secreción, a membrana plasmática o aorganelas del sistema endocítico. Una de las modificaciones post-traduccionales mas frecuentes, la N-glicosilación, está relacionada con el plegamiento de las proteínas ya que sin la adición de N-glicanos,numerosas especies proteicas son incapaces de alcanzar su conformación nativa. Losintermediarios de plegamiento, las proteínas oligoméricas no totalmente ensambladas, las proteínasmal plegadas y los agregados son selectivamente retenidos en el RE. El transporte hacia el aparatode Golgi ocurre solamente cuando las proteínas se han plegado y ensamblado correctamente. Elmecanismo que asegura la funcional de las proteínas que salen del RE, ha sido denominado “control de calidad del plegamiento de glicoproteínas". En la mayoría de los eucariotas la N-glicosilación comienza con la transferencia de unoligosacárido de composición Glc3Man9GlcNAc2 desde un intermediario lipídico (dolicoldifosfato) a la secuencia Asn-X-Ser/Thr de proteínas nacientes en el RE. Las tres glucosasterminales del oligosacárido transferido son inmediatamente removidas pordos glucosidasas del RE, I y II (GI y GII). Parodi y colaboradores demostraron la existencia de una reglucosilacióntransitoria de los N-oligosacáridos libres de glucosa dentro del RE por la acción de la enzimaluminal UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (GT). Esta enzima glucosila glicoproteínas, enensayos libres de células, sólo si éstas han sido previamente desnaturalizadas. Por estacaracterística especial se ha propuesto a la GT como posible sensor del estado conformacional delas glicoproteínas en el RE. Los oligosacáridos monoglucosilados, que se generan por ladeglucosilación parcial por la GI (encargada de remover la glucosa más externa) y GII (encargadade remover las dos glucosas más internas) y por la actividad de la GT, permiten la interacción delas glicoproteínas con dos lectinas del RE, la calreticulina (CRT) y/o calnexina (CNX). Estainteracción facilita el plegamiento de las glicoproteínas, evita la formación de agregados, permitela interacción de las glicoproteínas unidas a CNX con otras chaperonas del RE y constituye unmecanismo para retener en el RE las estructuras proteicas mal plegadas. En la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe existen todos los componentes delmodelo de control de calidad de glicoproteínas en el RE, ya que esta levadura expresa actividad GT y posee un homólogo de CNX. Además, el oligosacárido transferido a polipéptidos nacienteses Glc3Man9GlcNAc2 y este compuesto es procesado en el RE a Man9GlcNAc2, indicando lapresencia de actividades GI y GII. La disrupción del gen que codifica la CNX en S. pombe haresultado ser letal para estas células. Sin embargo una mutante deficiente en actividad GT (mutante gpt1) obtenida en nuestro laboratorio no posee ningún fenotipo distintivo. Esto planteóel interrogante de cuál es la importancia y el rol de la formación de oligosacáridosmonoglucosilados en el plegamiento de glicoproteínas en estas levaduras. En este trabajo serealizaron además experimentos destinados a analizar si una conformación mal plegada escondición suficiente para para la glucosilación de todos los olgosacáridos N-unidos a proteínas porla GT in vivo, tal como ocurre in vitro. En este trabajo de Tesis se presentan evidencias genéticas de la estructura heterodiméricapropuesta para la GII. La GII de S. pombe está compuesta de dos subunidades GIIα y GIIβ. Laactividad catalítica está presente en la subunidad GIIα, que carece de señal conocida parapermanecer en el RE. La subunidad GIIβ posee en el extremo C-temiinal el tetrapéptido VDEL,homólogo a conocidas señales de retención/recuperación en el lumen del RE. En S. pombe la CNX es esencial para la viabilidad celular. Sin embargo, la disrupción delgen que codifica para GIIα abolió totalmente la formación de oligosacáridos monoglucosilados,tanto por deglucosilación del compuesto transferido a las proteinas como por reglucosilaciónmediada por la GT. Estas mutantes de S. pombe resultaron viables a todas las temperaturasensayadas. Esto significa que la CNX y no los oligosacáridos monoglucosilados son esencialespara esta levadura en condiciones normales de crecimiento. Si bien la formación de oligosacáridos monoglucosilados no es esencial para la viabilidadcelular, células defectivas total (mutantes GIIα-) o parcialmente (mutantes GIIβ- o GT-) en laformación de oligosacáridos monoglucosilados presentaron una acumulación de proteínas malplegadas en el RE en ausencia de estrés adicional. Esto se evidenció por la inducción demensajeros que codifican para chaperonas del RE (respuesta a proteínas mal plegadas o UPR). Laacumulación de proteínas mal plegadas en estas mutantes se evidenció además por la presencia ensus glicoproteínas de una mayor proporción de oligosacáridos con estructuras específicas del RE yno del aparato de Golgi. Los glicanos sintetizados por estas mutantes son similares a los obtenidoscuando se agregó a células salvajes un agente reductor que provoca un mal plegamiento en lasglicoproteínas que se están sintetizando en el RE. Tal como fue descripto para células demamifero, en células intactas de S. pombe la formación de oligosacáridos monoglucosiladosreduce la velocidad de plegamiento, pero incrementa su eficiencia. Esto fue evidenciado por unacomparación de la cantidad de carboxipeptidasa y la velocidad de llegada a la vacuola de estaproteína en células salvajes y GIIα-. Este resultado indicó que los oligosacáridosmonoglucosilados están involucrados en la facilitación del plegamiento de las glicoproteínas de S. pombe. La formación de proteínas mal plegadas causada tanto por el agregado de una agente queimpide la formación de puentes disulfuro (ditiotreitol) a células intactas, como por un shock decalor, no fueron condiciones suficientes para la glucosilación in vivo mediada por la GT. dichostratamientos no resultaron en un aumento generalizado de la glucosilación. La explicación paraeste resultado podría estar en las restricciones de la GT para reconocer sus sustratos:aparentemente la GT sólo glucosilaría glicoproteínas que presentan una estructura parcial o unintermediario del plegamiento con flexibilidad limitada, ausente en las formas completamentedesplegadas. Estos resultados sugieren que las glicoproteínas que se pliegan en el RE sonsometidas al sistema de control de calidad del plegamiento en las etapas finales del proceso deplegamiento. |
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