Rol de los oligosacáridos monoglucosilados en el plegamiento de glicoproteínas en Schizosacchatomyces pombe

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El retículo endoplasmático (RE) es el compartimiento de varias modificación post-traduccionalesy plegamiento de proteínas destinadas a secreción, a membrana plasmática o aorganelas del sistema endocítico. Una de las modificaciones post-traduccionales mas frecuentes, la N-glicosilación, está relacion...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	D'Alessio, Cecilia
Otros Autores:	Parodi, Armando J.
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2001
Materias:	GLUCOSIDASA II GLUCOSILTRANSFERASA PLEGAMIENTO DE GLICOPROTEINAS SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE GLUCOSIDASE II GLUCOSYLTRANSFERASE GLYCOPROTEIN FOLDING
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3360_DAlessio http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n3360_DAlessio_oai
Aporte de:	Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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description	El retículo endoplasmático (RE) es el compartimiento de varias modificación post-traduccionalesy plegamiento de proteínas destinadas a secreción, a membrana plasmática o aorganelas del sistema endocítico. Una de las modificaciones post-traduccionales mas frecuentes, la N-glicosilación, está relacionada con el plegamiento de las proteínas ya que sin la adición de N-glicanos,numerosas especies proteicas son incapaces de alcanzar su conformación nativa. Losintermediarios de plegamiento, las proteínas oligoméricas no totalmente ensambladas, las proteínasmal plegadas y los agregados son selectivamente retenidos en el RE. El transporte hacia el aparatode Golgi ocurre solamente cuando las proteínas se han plegado y ensamblado correctamente. Elmecanismo que asegura la funcional de las proteínas que salen del RE, ha sido denominado “control de calidad del plegamiento de glicoproteínas". En la mayoría de los eucariotas la N-glicosilación comienza con la transferencia de unoligosacárido de composición Glc3Man9GlcNAc2 desde un intermediario lipídico (dolicoldifosfato) a la secuencia Asn-X-Ser/Thr de proteínas nacientes en el RE. Las tres glucosasterminales del oligosacárido transferido son inmediatamente removidas pordos glucosidasas del RE, I y II (GI y GII). Parodi y colaboradores demostraron la existencia de una reglucosilacióntransitoria de los N-oligosacáridos libres de glucosa dentro del RE por la acción de la enzimaluminal UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (GT). Esta enzima glucosila glicoproteínas, enensayos libres de células, sólo si éstas han sido previamente desnaturalizadas. Por estacaracterística especial se ha propuesto a la GT como posible sensor del estado conformacional delas glicoproteínas en el RE. Los oligosacáridos monoglucosilados, que se generan por ladeglucosilación parcial por la GI (encargada de remover la glucosa más externa) y GII (encargadade remover las dos glucosas más internas) y por la actividad de la GT, permiten la interacción delas glicoproteínas con dos lectinas del RE, la calreticulina (CRT) y/o calnexina (CNX). Estainteracción facilita el plegamiento de las glicoproteínas, evita la formación de agregados, permitela interacción de las glicoproteínas unidas a CNX con otras chaperonas del RE y constituye unmecanismo para retener en el RE las estructuras proteicas mal plegadas. En la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe existen todos los componentes delmodelo de control de calidad de glicoproteínas en el RE, ya que esta levadura expresa actividad GT y posee un homólogo de CNX. Además, el oligosacárido transferido a polipéptidos nacienteses Glc3Man9GlcNAc2 y este compuesto es procesado en el RE a Man9GlcNAc2, indicando lapresencia de actividades GI y GII. La disrupción del gen que codifica la CNX en S. pombe haresultado ser letal para estas células. Sin embargo una mutante deficiente en actividad GT (mutante gpt1) obtenida en nuestro laboratorio no posee ningún fenotipo distintivo. Esto planteóel interrogante de cuál es la importancia y el rol de la formación de oligosacáridosmonoglucosilados en el plegamiento de glicoproteínas en estas levaduras. En este trabajo serealizaron además experimentos destinados a analizar si una conformación mal plegada escondición suficiente para para la glucosilación de todos los olgosacáridos N-unidos a proteínas porla GT in vivo, tal como ocurre in vitro. En este trabajo de Tesis se presentan evidencias genéticas de la estructura heterodiméricapropuesta para la GII. La GII de S. pombe está compuesta de dos subunidades GIIα y GIIβ. Laactividad catalítica está presente en la subunidad GIIα, que carece de señal conocida parapermanecer en el RE. La subunidad GIIβ posee en el extremo C-temiinal el tetrapéptido VDEL,homólogo a conocidas señales de retención/recuperación en el lumen del RE. En S. pombe la CNX es esencial para la viabilidad celular. Sin embargo, la disrupción delgen que codifica para GIIα abolió totalmente la formación de oligosacáridos monoglucosilados,tanto por deglucosilación del compuesto transferido a las proteinas como por reglucosilaciónmediada por la GT. Estas mutantes de S. pombe resultaron viables a todas las temperaturasensayadas. Esto significa que la CNX y no los oligosacáridos monoglucosilados son esencialespara esta levadura en condiciones normales de crecimiento. Si bien la formación de oligosacáridos monoglucosilados no es esencial para la viabilidadcelular, células defectivas total (mutantes GIIα-) o parcialmente (mutantes GIIβ- o GT-) en laformación de oligosacáridos monoglucosilados presentaron una acumulación de proteínas malplegadas en el RE en ausencia de estrés adicional. Esto se evidenció por la inducción demensajeros que codifican para chaperonas del RE (respuesta a proteínas mal plegadas o UPR). Laacumulación de proteínas mal plegadas en estas mutantes se evidenció además por la presencia ensus glicoproteínas de una mayor proporción de oligosacáridos con estructuras específicas del RE yno del aparato de Golgi. Los glicanos sintetizados por estas mutantes son similares a los obtenidoscuando se agregó a células salvajes un agente reductor que provoca un mal plegamiento en lasglicoproteínas que se están sintetizando en el RE. Tal como fue descripto para células demamifero, en células intactas de S. pombe la formación de oligosacáridos monoglucosiladosreduce la velocidad de plegamiento, pero incrementa su eficiencia. Esto fue evidenciado por unacomparación de la cantidad de carboxipeptidasa y la velocidad de llegada a la vacuola de estaproteína en células salvajes y GIIα-. Este resultado indicó que los oligosacáridosmonoglucosilados están involucrados en la facilitación del plegamiento de las glicoproteínas de S. pombe. La formación de proteínas mal plegadas causada tanto por el agregado de una agente queimpide la formación de puentes disulfuro (ditiotreitol) a células intactas, como por un shock decalor, no fueron condiciones suficientes para la glucosilación in vivo mediada por la GT. dichostratamientos no resultaron en un aumento generalizado de la glucosilación. La explicación paraeste resultado podría estar en las restricciones de la GT para reconocer sus sustratos:aparentemente la GT sólo glucosilaría glicoproteínas que presentan una estructura parcial o unintermediario del plegamiento con flexibilidad limitada, ausente en las formas completamentedesplegadas. Estos resultados sugieren que las glicoproteínas que se pliegan en el RE sonsometidas al sistema de control de calidad del plegamiento en las etapas finales del proceso deplegamiento.
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En la mayoría de los eucariotas la N-glicosilación comienza con la transferencia de unoligosacárido de composición Glc3Man9GlcNAc2 desde un intermediario lipídico (dolicoldifosfato) a la secuencia Asn-X-Ser/Thr de proteínas nacientes en el RE. Las tres glucosasterminales del oligosacárido transferido son inmediatamente removidas pordos glucosidasas del RE, I y II (GI y GII). Parodi y colaboradores demostraron la existencia de una reglucosilacióntransitoria de los N-oligosacáridos libres de glucosa dentro del RE por la acción de la enzimaluminal UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (GT). Esta enzima glucosila glicoproteínas, enensayos libres de células, sólo si éstas han sido previamente desnaturalizadas. Por estacaracterística especial se ha propuesto a la GT como posible sensor del estado conformacional delas glicoproteínas en el RE. Los oligosacáridos monoglucosilados, que se generan por ladeglucosilación parcial por la GI (encargada de remover la glucosa más externa) y GII (encargadade remover las dos glucosas más internas) y por la actividad de la GT, permiten la interacción delas glicoproteínas con dos lectinas del RE, la calreticulina (CRT) y/o calnexina (CNX). Estainteracción facilita el plegamiento de las glicoproteínas, evita la formación de agregados, permitela interacción de las glicoproteínas unidas a CNX con otras chaperonas del RE y constituye unmecanismo para retener en el RE las estructuras proteicas mal plegadas. En la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe existen todos los componentes delmodelo de control de calidad de glicoproteínas en el RE, ya que esta levadura expresa actividad GT y posee un homólogo de CNX. Además, el oligosacárido transferido a polipéptidos nacienteses Glc3Man9GlcNAc2 y este compuesto es procesado en el RE a Man9GlcNAc2, indicando lapresencia de actividades GI y GII. La disrupción del gen que codifica la CNX en S. pombe haresultado ser letal para estas células. Sin embargo una mutante deficiente en actividad GT (mutante gpt1) obtenida en nuestro laboratorio no posee ningún fenotipo distintivo. Esto planteóel interrogante de cuál es la importancia y el rol de la formación de oligosacáridosmonoglucosilados en el plegamiento de glicoproteínas en estas levaduras. En este trabajo serealizaron además experimentos destinados a analizar si una conformación mal plegada escondición suficiente para para la glucosilación de todos los olgosacáridos N-unidos a proteínas porla GT in vivo, tal como ocurre in vitro. En este trabajo de Tesis se presentan evidencias genéticas de la estructura heterodiméricapropuesta para la GII. La GII de S. pombe está compuesta de dos subunidades GIIα y GIIβ. Laactividad catalítica está presente en la subunidad GIIα, que carece de señal conocida parapermanecer en el RE. La subunidad GIIβ posee en el extremo C-temiinal el tetrapéptido VDEL,homólogo a conocidas señales de retención/recuperación en el lumen del RE. En S. pombe la CNX es esencial para la viabilidad celular. Sin embargo, la disrupción delgen que codifica para GIIα abolió totalmente la formación de oligosacáridos monoglucosilados,tanto por deglucosilación del compuesto transferido a las proteinas como por reglucosilaciónmediada por la GT. Estas mutantes de S. pombe resultaron viables a todas las temperaturasensayadas. Esto significa que la CNX y no los oligosacáridos monoglucosilados son esencialespara esta levadura en condiciones normales de crecimiento. Si bien la formación de oligosacáridos monoglucosilados no es esencial para la viabilidadcelular, células defectivas total (mutantes GIIα-) o parcialmente (mutantes GIIβ- o GT-) en laformación de oligosacáridos monoglucosilados presentaron una acumulación de proteínas malplegadas en el RE en ausencia de estrés adicional. Esto se evidenció por la inducción demensajeros que codifican para chaperonas del RE (respuesta a proteínas mal plegadas o UPR). Laacumulación de proteínas mal plegadas en estas mutantes se evidenció además por la presencia ensus glicoproteínas de una mayor proporción de oligosacáridos con estructuras específicas del RE yno del aparato de Golgi. Los glicanos sintetizados por estas mutantes son similares a los obtenidoscuando se agregó a células salvajes un agente reductor que provoca un mal plegamiento en lasglicoproteínas que se están sintetizando en el RE. Tal como fue descripto para células demamifero, en células intactas de S. pombe la formación de oligosacáridos monoglucosiladosreduce la velocidad de plegamiento, pero incrementa su eficiencia. Esto fue evidenciado por unacomparación de la cantidad de carboxipeptidasa y la velocidad de llegada a la vacuola de estaproteína en células salvajes y GIIα-. Este resultado indicó que los oligosacáridosmonoglucosilados están involucrados en la facilitación del plegamiento de las glicoproteínas de S. pombe. La formación de proteínas mal plegadas causada tanto por el agregado de una agente queimpide la formación de puentes disulfuro (ditiotreitol) a células intactas, como por un shock decalor, no fueron condiciones suficientes para la glucosilación in vivo mediada por la GT. dichostratamientos no resultaron en un aumento generalizado de la glucosilación. La explicación paraeste resultado podría estar en las restricciones de la GT para reconocer sus sustratos:aparentemente la GT sólo glucosilaría glicoproteínas que presentan una estructura parcial o unintermediario del plegamiento con flexibilidad limitada, ausente en las formas completamentedesplegadas. Estos resultados sugieren que las glicoproteínas que se pliegan en el RE sonsometidas al sistema de control de calidad del plegamiento en las etapas finales del proceso deplegamiento. The endoplasmic reticulum (ER) is the intracellular location of some post-translationalmodifications and folding of proteins destined to secretion, to the plasma membrane or toorganelles of the endocytic system. N-glycosylation is one of the most frequent modifications. Thismodification is related to protein folding, as many species are unable of properly fold without N-glycanaddition. Folding intermediates, incomplete assembled oligomers, misfolded proteins andaggregates are selectively retained in the ER. Transport to Golgi compartments takes place only ifproteins are in their native conformation and properly assembled. The mechanism that ensures thefunctionality of proteins that exit the ER, is the so called “quality control of glycoprotein folding”. In most eucariotic cells, N-glycosylation is initiated on transfer of an oligosaccharide (Glc3Man9GlcNAc2)from a lipid-carrier (dolichyl diphosphate), to the sequence Asn-X-Ser/Thr innascent proteins in the ER. The three terminal glucose residues of the transferred oligosaccharideare irnmediately trimmed by two ER glucosidases, I and II (GI and GII). Parodi and coworkersdemonstrated the occurrence of transient reglucosylation of glucose-free N-linkedoligosaccharides in the ER by a lumenal enzyme, the UDP-Glc:glycoprotein glucosyltransferase (GT). This enzyme glucosylates glycoproteins in a cell-free assay, only if they have beenpreviously denatured. For this especial feature, GT has been proposed as a possible sensor ofglycoprotein conformation in the ER. Monoglucosylated oligosaccharides can be generated bypartial deglucosylation by of GI (that removes the most terminal glucose) and GII (that trims bothinner glucose residues), or by GT. Monoglucosylated oligosaccharides allow interaction ofglycoproteins with two ER lectins, calnexin (CNX) and/or calreticulin (CRT). This interactionfacilitates glycoprotein folding, avoids aggregation of glycoproteins, allows interaction of boundglycoproteins with the ER chaperone system and constitutes a retaining mechanism of misfoldedglycoproteins in the ER. The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has the three elements of the quality controlof glycoprotein folding in the ER as this yeast expresses a GT activity and a CNX homologue. Inaddition, the oligosaccharide transferred to nascent polypeptides is Glc3Man9GlcNAc2 and thiscompound is processed in the ER to Man9GlcNac2 indicating the presence of both GI and GIIactivities. The disruption of the gene encoding CNX in S. pombe has been shown to be lethal. However, a mutant lacking GT activity (gpt1) obtained in our laboratory had no discerniblephenotype. This raised the question of the actual importance of monoglucosylated oligosaccharideformation in glycoprotein folding in this yeast and its role in glycoprotein folding. Further workreported here was performed in order to test whether a misfolded conformation is a sufficientcondition for in vivo glucosylation of all N-linked oligosaccharides by GT as was observed invitro. Results presented herein provide genetic support for a proposed heterodimeric structure of GII. S. pombe GII appears to be composed by two subunits GIIα and GIIβ. Catalytic activity iscontained in GIIα subunit, which in turn lacks any known ER retrieval signal. GIIβ has in its C-terminalsequence the tetrapeptide VDEL, homologous to known lumenal ER retrieval signal. Amodel is proposed in which GII β-subunit functions as the retrieval element of GII α-subunit tothe ER. CNX resulted essential for S. pombe viability. However, GIIα subunit disruptioncompletely abolished the formation of monoglucosylated oligosaccharides, both bydeglucosylation of the transferred compound as by GT-mediated reglucosylation. This mutant wasviable at all temperatures tested. It was concluded that CNX but not monoglucosylatedoligosaccharides is essential for this yeast. Although monoglucosylated oligosaccharide formation is not essential for cell viability,cells totally (GIIα minus) or partially (GIIβ or GT minus) defective in monoglucosylatedoligosaccharide formation showed accumulation of misfolded proteins in the ER in the absence ofany exogenous stress. This was evidenced by the induction of mRNAs encoding ER chaperones (unfolded protein response). Besides, misfolding of glycoproteins in those mutants was reveled bythe much higher proportion of protein-linked oligosaccharides having ER-specific structures andlacking Golgi-specific modifications. Glycans synthesized by the mutants displayed sizes similar tothose found when a reducing agent that prevents proper protein folding in the ER was added towild type cells. As was described for mammalian cells, also in intact S. pombe cells formation ofmonoglucosylated oligosaccharide decreased the folding rate but increased the folding efficiencyas judged by comparison of amounts and rates of arrival of carboxypeptidase Y to the vacuole inwild type and GIIα minus cells. This result indicated that monoglucosylated glycans are indeedinvolved in glycoprotein folding facilitation in the fission yeast. Protein misfolding caused both by addition of a reagent that prevents disulfide bondformation (dithiothreitol) to intact cells as well as by a heat shock treatment were not conditionssufficient for in vivo GT-mediated glucosylation. Those treatments did not result in a generalizedglycoprotein glucosylation. The explanation for this result may lie in GT restrictions to recognizeits substrates. Apparently GT only glucosylates partially structured conformers or foldinginterrnediates bearing a limited flexibility that is absent in less structured species. These resultssuggest that glycoproteins are mainly subjected to ER quality control in the last folding stages. Fil: D'Alessio, Cecilia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3360_DAlessio spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar GLUCOSIDASA II GLUCOSILTRANSFERASA PLEGAMIENTO DE GLICOPROTEINAS SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE GLUCOSIDASE II GLUCOSYLTRANSFERASE GLYCOPROTEIN FOLDING SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE Rol de los oligosacáridos monoglucosilados en el plegamiento de glicoproteínas en Schizosacchatomyces pombe Role of monoglucosylated oligosaccharides in glycoprotein folding facilitation in Schzosaccharomyces pombe info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n3360_DAlessio_oai

Rol de los oligosacáridos monoglucosilados en el plegamiento de glicoproteínas en Schizosacchatomyces pombe

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