Purificación, caracterización, clonado y expresión de malato dehidrogenasas del helminto parásito Echinococcus granulosus

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Las isoformas de malato dehidrogenasa presentes en protoescólices de E. granalosus fueron purificadas ahomogeneidad, mediante un protocolo que incluye un fraccionamiento con sulfato de amonio y la separación delas isoformas citosólica y mitocondrial mediante cromatografía de afinidad en 5'-AMP-...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Agüero, Fernán Gonzalo
Otros Autores: Cazzulo, Juan José
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2001
Materias:
ECHINOCOCCUS GRANULOSUS
MALATO DEHIDROGENASA
MDH
METABOLISMO INTERMEDIARIO
MALATE DEHYDROGENASE
INTERMEDIARY METABOLISM
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3350_Aguero
https://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n3350_Aguero_oai
Aporte de:
Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description Las isoformas de malato dehidrogenasa presentes en protoescólices de E. granalosus fueron purificadas ahomogeneidad, mediante un protocolo que incluye un fraccionamiento con sulfato de amonio y la separación delas isoformas citosólica y mitocondrial mediante cromatografía de afinidad en 5'-AMP-Sefarosa. La mMDH es llevadaa homogeneidad mediante la adición de una cromatografía de afinidad en Blue Sepharose. La cMDH en cambio espurificada siguiendo un protocolo ya descripto que incluye cromatografía de intercambio iónico en DEAE-celulosa,filtración molecular en columna de Superosa 12 y cromatografía de afinidad en Blue Sepharose.la identidad de las isoformas fue confirmada mediante i) el estudio del comportamiento cinético de ambas enpresencia de exceso del sustrato oxaloacetato, ii) el comportamiento diferencial que muestran las dos isoformasfrente al detergente catiónico CTAB y iii) la secuenciación de péptidos a partir de ambas. En el caso de la mMDH, cuyo gen no se encontraba clonado, la información peptídica obtenida permitió comenzarel clonado del mismo, por amplificación de dos fragmentos del ADNc codificante de la enzima. Con ellos, se rastreóuna biblioteca de ADNc de protoescólices que permitió extender la secuencia del ADNc hacia el extremo 3'. Finalmente, la secuencia del ADNc se completó utilizando la técnica de amplificación rápida de extremos de ADNc (5' RACE), que permitió amplificar y secuencia: el extremo 5’ faltante. El ADNc completo fue utilizado para expresar,en forma recombinante, a la mMDH, en forma de fusión con la glutation-S-transferasa de S. japonicum. La proteínarecombinante resultó activa y los parámetros cinéticos de la misma fueron comparados con los obtenidos para laenzima obtenida de la fuente natural. La cMDH recombinante, clonada y expresada por el grupo del Dr. Arnaldo Zaha también fue comparadacinéticamente con la enzima natural purificada en esta Tesis.
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spelling I28-R145-tesis_n3350_Aguero_oai2024-09-02 Cazzulo, Juan José Agüero, Fernán Gonzalo 2001 Las isoformas de malato dehidrogenasa presentes en protoescólices de E. granalosus fueron purificadas ahomogeneidad, mediante un protocolo que incluye un fraccionamiento con sulfato de amonio y la separación delas isoformas citosólica y mitocondrial mediante cromatografía de afinidad en 5'-AMP-Sefarosa. La mMDH es llevadaa homogeneidad mediante la adición de una cromatografía de afinidad en Blue Sepharose. La cMDH en cambio espurificada siguiendo un protocolo ya descripto que incluye cromatografía de intercambio iónico en DEAE-celulosa,filtración molecular en columna de Superosa 12 y cromatografía de afinidad en Blue Sepharose.la identidad de las isoformas fue confirmada mediante i) el estudio del comportamiento cinético de ambas enpresencia de exceso del sustrato oxaloacetato, ii) el comportamiento diferencial que muestran las dos isoformasfrente al detergente catiónico CTAB y iii) la secuenciación de péptidos a partir de ambas. En el caso de la mMDH, cuyo gen no se encontraba clonado, la información peptídica obtenida permitió comenzarel clonado del mismo, por amplificación de dos fragmentos del ADNc codificante de la enzima. Con ellos, se rastreóuna biblioteca de ADNc de protoescólices que permitió extender la secuencia del ADNc hacia el extremo 3'. Finalmente, la secuencia del ADNc se completó utilizando la técnica de amplificación rápida de extremos de ADNc (5' RACE), que permitió amplificar y secuencia: el extremo 5’ faltante. El ADNc completo fue utilizado para expresar,en forma recombinante, a la mMDH, en forma de fusión con la glutation-S-transferasa de S. japonicum. La proteínarecombinante resultó activa y los parámetros cinéticos de la misma fueron comparados con los obtenidos para laenzima obtenida de la fuente natural. La cMDH recombinante, clonada y expresada por el grupo del Dr. Arnaldo Zaha también fue comparadacinéticamente con la enzima natural purificada en esta Tesis. The isoforms of malate dehydrogenase present in protoscolices of E. granulosus were purified to homogeneity usinga protocol that includes an ammonium sulfate precipitation step and an afinity chromatogmphy step on 5’-AMP Sepharoseto separate cMDH from mMDH. The mMDH is obtained in apparently homogeneous form by anadditional affinity chromatography step on Blue Sepharose. The cMDH is purified following a previously describedprotocol that includes ion exchange chromatography on DEAE-cellulose, gel filtration on Superose 12 columns andaffinity chromatography on Blue Sepharose. The identity of the purified isoforms was confirmed based on i) the kinetic behaviour of the enzymes in thepresence of an excess of oxaloacetate, ii) the differential behaviour shown in the presence of the cationic detergent CTAB, and iii) by sequencing of internal peptides from both isoforms. Peptide information from mMDH was used to start the cloning of its gene. This information allowed us to amplifytwo fragments from the cDNA that were then used to screen a protoscolex cDNA library and obtain a positive phagewhich contained sequence information corresponding to the 3’ end of the cDNA. The remaining 5' end wasamplified using the 5' RACE technique. The full-length CDNA was then used to produce recombinant mMDH as afusion protein with the S. japonicum glutathione-S-transferase. The recombinant protein was active and its kineticparameters were compared with those of the natural enzyme. The recombinant cMDH, cloned and expressed by Dr. Zaha’s group was also compared kinetically with the naturalenzyme purified in this Thesis. Fil: Agüero, Fernán Gonzalo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3350_Aguero spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar ECHINOCOCCUS GRANULOSUS MALATO DEHIDROGENASA MDH METABOLISMO INTERMEDIARIO ECHINOCOCCUS GRANULOSUS MALATE DEHYDROGENASE MDH INTERMEDIARY METABOLISM Purificación, caracterización, clonado y expresión de malato dehidrogenasas del helminto parásito Echinococcus granulosus Purification, characterization, cloning and expression of malate dehydrogenases from the parasitic helminth Echinococcus granulosus info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion https://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n3350_Aguero_oai

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