Purificación y estudio de las características estructurales, cinéticas y regulatorias de la pep-carboxiquinasa del Trypanosoma cruzi

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l) Se purificó a homogeneidad la PEPCK del T.cruziutilizando el siguiente procedimiento: a) ruptura de las células por tratamiento conultrasonido. b) precipitación fraccionada con (NH4)2SO4. c) cromatografía en columna de Sephadex G-200. d) DEAE-celulosa. e) Hidroxilapatita. f) ATP-agarosa. El crite...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Cymeryng, Cora Beatriz
Otros Autores: Cannata, Joaquín Juan Bautista
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 1991
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2430_Cymeryng
http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n2430_Cymeryng_oai
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description l) Se purificó a homogeneidad la PEPCK del T.cruziutilizando el siguiente procedimiento: a) ruptura de las células por tratamiento conultrasonido. b) precipitación fraccionada con (NH4)2SO4. c) cromatografía en columna de Sephadex G-200. d) DEAE-celulosa. e) Hidroxilapatita. f) ATP-agarosa. El criterio de pureza utilizado fue la presencia de unaúnica banda en las electroforesis en geles depoliacrilamida en condiciones disociantes. La purificación lograda fue de 488 veces con unrendimiento del 7.2 %. 2) El análisis de la composición de aminoácidos indicóuna alta proporción de medias cisteínas y unarelativamente baja de prolina en comparación con losvalores obtenidos con enzimas de otros origenes. Elvolumen parcial específico, calculado a partir de lacomposición de aminoácidos fue de 0.730 cm3/g. 3) Se calcularon los parámetros hidrodinámicos ymoleculares de la enzima por filtración en geles,ultracentrifugación en gradientes de sacarosa,electroforesis en condiciones disociantes ycromatoenfocado obteniéndose los siguientes valores:coeficiente de sedimentación, S20,w= 6.7 10^(-13) seg;coeficiente de difusión libre, D20,w=4.9 10^(-7) cm2seg^(-1);radio de Stokes, a= 44.56 Å y punto isoeléctrico de 7.3. El peso molecular de la enzima nativa, calculadoutilizando la ecuación de Svedberg, fue de 123.000 Da,lo que coincide con el resultado obtenido con el Métodode Andrews. El peso molecular de la subunidad fue de 61 kDa por lo que la enzima sería un dímero. El cociente friccional de la enzima fue de 1.36 lo queindicaría una estructura levemente asimétrica. 4) Se determinó el pH óptimo para las tres reaccionescatalizadas por la enzima: carboxilación [6.55],formación de PEP [7.76] e intercambio [6.48],encontrándose que la enzima es más activa en ladirección de formación de PEP. 5) La especificidad hacia los nucleótidos varió según lareacción considerada. En las reacciones de intercambio yde formación de PEP si bien la enzima mostró actividaden todos los casos esta fue mayor con los nucleótidospúricos. En el caso de la reacción de carboxilación laenzima presentó una especificidad absoluta por ADP. No se observó inhibición significativa cuando seensayaron los distintos nucleótidos en las reaccionesde carboxilación y de formación de PEP cuando elsustrato era el nucleótido de adenina. Sin embargo,cuando el GTP era el sustrato para la reacción deformación de PEP, todos los nucleótidos presentaron unefecto inhibitorio importante. En el caso de la reacciónde intercambio tanto con ATP como con GTP como sustratosla inhibición fue mayor con los nucleótidospirimidínicos y con el nucleótido de inosina que con losde adenina y guanina. Por otra parte ni el IDP ni el ITPejercieron efecto inhibitorio significativo sobre lareacción de carboxilación (sustrato: ADP)o la reacciónde formación de PEP (sustrato: ATP) respectivamente. 6) A1 igual que la enzima aislada de otras fuentes la PEPCK presentó un requerimiento absoluto por metaldivalente. En este sentido el Mn^(2)+ fue el más efectivosiguiéndole en importancia el Cd^(2)+, aunque en ese casola concentración de metal requerida para lograr lamayor activación fue significativamente menor. La enzimapresentó una cinética michaeliana al ensayarla enpresencia de Mn^(2)+, Cd^(2)+ y Mg^(2)+. Tanto el Cd^(2)+ como el Mg^(2)+ ejercieron un efectosinérgico con el Mn^(2)+ siendo los gráficos de doblesrecíprocos bifásicos en ambos casos. 7) Se determinaron los parámetros cinéticos para lastres reacciones: a) Carboxilación: Km PEP= 35 uM; Km ADP-Mn= 16 uM y Km NaHCO3= 2.6 mM, Vmax= 3.2 umoles/min/mg. b) Formación de PEP: Km0A= 49 uM, KmATP-Mn= 27 uM, Vmax=31.7 umoles/min/mg. c) Intercambio: S0.5 0A : 41 uM (ATP), 41 uM (GTP) connH= 1.6 y Km ATP-Mn= 37 uM, Vmax= 0.97 umoles/min/mg. 8) Se estudió también el efecto histerético deactivación de la enzima en la mezcla de reacción durantela determinación de la actividad de carboxilaciónencontrándose una relación entre dicho efecto y laconcentración proteica de la muestra enzimáticaestudiada. El efecto de histéresis desaparecia cuando laenzima se sometía a diálisis pero se recuperaba por elagregado de sales a la mezcla de reacción, siendo en esesentido el (NH4)2SO4 el más efectivo. 9) El quinolinato, catabolito del triptofano eintermediario en la síntesis de NAD+ fue un inhibidortanto de la actividad de intercambio como de la decarboxilación de la PEPCK aislada del T. cruzi. 10) Se estudió también el efecto de inhibidores deenzimas con grupos tioles encontrándose que la enzima esmuy sensible al efecto de los mercuriales orgánicos (CMS, FMA y PCMB)y también se inhibe significativamenteen presencia de O-Iodosobenzoato, NEM, Iodoacetamida y DTNB. La reversión de la inhibición con DTT indicó queesta última se debía a un efecto de los reactivos sobrelos grupos tioles.ll) No se encontraron distintas formas moleculares de laenzima utilizando la cromatografía líquida rápida paraproteínas. Tampoco pudieron encontrarse productos demenor tamaño provenientes del tratamiento de la enzimaaltamente purificada con la proteinasa cuantitativamentemás importante del T.cruzi. 12) Se estudió también una actividad oxaloacéticodecarboxilásica asociada a la PEPCK y que posiblementesea intrínseca de la enzima. Dicha actividad no fuemodificada significativamente por los nucleósidosdifosfato. Con respecto al efecto de los metales seobservó una activación en presencia de Cd^(2)+ y de Mn^(2)+ pero sólo cuando la concentración de los metalesera menor de 50 uM. 13) Se puso de manifiesto la presencia en epimastigotesde T. cruzi de una actividad oxaloacéticodecarboxilásica independiente de la PEPCK y altamenteactivable por Cd^(2)+. Dicha actividad se encontró en mayorproporción en extractos provenientes del tratamiento delas células por congelamiento y descongelamientopermaneciendo la mayor proporción de la actividadcarboxiquinásica en el sedimento de dicho tratamiento. La cromatografía en ATP-agarosa de dicho extractopermitió una separación parcial de ambas actividades (carboxiquinásica y oxaloacético decarboxilásicadependiente de Cd^(2)+). La curva de pH para el extractoproveniente del tratamiento por congelamiento ydescongelamiento mostró dos máximos para la actividad 0D (Cd2+) [5.4 y 6.65] y uno para la actividad OD enausencia de metal [5.4].
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spelling I28-R145-tesis_n2430_Cymeryng_oai2023-04-26 Cannata, Joaquín Juan Bautista Cymeryng, Cora Beatriz 1991 l) Se purificó a homogeneidad la PEPCK del T.cruziutilizando el siguiente procedimiento: a) ruptura de las células por tratamiento conultrasonido. b) precipitación fraccionada con (NH4)2SO4. c) cromatografía en columna de Sephadex G-200. d) DEAE-celulosa. e) Hidroxilapatita. f) ATP-agarosa. El criterio de pureza utilizado fue la presencia de unaúnica banda en las electroforesis en geles depoliacrilamida en condiciones disociantes. La purificación lograda fue de 488 veces con unrendimiento del 7.2 %. 2) El análisis de la composición de aminoácidos indicóuna alta proporción de medias cisteínas y unarelativamente baja de prolina en comparación con losvalores obtenidos con enzimas de otros origenes. Elvolumen parcial específico, calculado a partir de lacomposición de aminoácidos fue de 0.730 cm3/g. 3) Se calcularon los parámetros hidrodinámicos ymoleculares de la enzima por filtración en geles,ultracentrifugación en gradientes de sacarosa,electroforesis en condiciones disociantes ycromatoenfocado obteniéndose los siguientes valores:coeficiente de sedimentación, S20,w= 6.7 10^(-13) seg;coeficiente de difusión libre, D20,w=4.9 10^(-7) cm2seg^(-1);radio de Stokes, a= 44.56 Å y punto isoeléctrico de 7.3. El peso molecular de la enzima nativa, calculadoutilizando la ecuación de Svedberg, fue de 123.000 Da,lo que coincide con el resultado obtenido con el Métodode Andrews. El peso molecular de la subunidad fue de 61 kDa por lo que la enzima sería un dímero. El cociente friccional de la enzima fue de 1.36 lo queindicaría una estructura levemente asimétrica. 4) Se determinó el pH óptimo para las tres reaccionescatalizadas por la enzima: carboxilación [6.55],formación de PEP [7.76] e intercambio [6.48],encontrándose que la enzima es más activa en ladirección de formación de PEP. 5) La especificidad hacia los nucleótidos varió según lareacción considerada. En las reacciones de intercambio yde formación de PEP si bien la enzima mostró actividaden todos los casos esta fue mayor con los nucleótidospúricos. En el caso de la reacción de carboxilación laenzima presentó una especificidad absoluta por ADP. No se observó inhibición significativa cuando seensayaron los distintos nucleótidos en las reaccionesde carboxilación y de formación de PEP cuando elsustrato era el nucleótido de adenina. Sin embargo,cuando el GTP era el sustrato para la reacción deformación de PEP, todos los nucleótidos presentaron unefecto inhibitorio importante. En el caso de la reacciónde intercambio tanto con ATP como con GTP como sustratosla inhibición fue mayor con los nucleótidospirimidínicos y con el nucleótido de inosina que con losde adenina y guanina. Por otra parte ni el IDP ni el ITPejercieron efecto inhibitorio significativo sobre lareacción de carboxilación (sustrato: ADP)o la reacciónde formación de PEP (sustrato: ATP) respectivamente. 6) A1 igual que la enzima aislada de otras fuentes la PEPCK presentó un requerimiento absoluto por metaldivalente. En este sentido el Mn^(2)+ fue el más efectivosiguiéndole en importancia el Cd^(2)+, aunque en ese casola concentración de metal requerida para lograr lamayor activación fue significativamente menor. La enzimapresentó una cinética michaeliana al ensayarla enpresencia de Mn^(2)+, Cd^(2)+ y Mg^(2)+. Tanto el Cd^(2)+ como el Mg^(2)+ ejercieron un efectosinérgico con el Mn^(2)+ siendo los gráficos de doblesrecíprocos bifásicos en ambos casos. 7) Se determinaron los parámetros cinéticos para lastres reacciones: a) Carboxilación: Km PEP= 35 uM; Km ADP-Mn= 16 uM y Km NaHCO3= 2.6 mM, Vmax= 3.2 umoles/min/mg. b) Formación de PEP: Km0A= 49 uM, KmATP-Mn= 27 uM, Vmax=31.7 umoles/min/mg. c) Intercambio: S0.5 0A : 41 uM (ATP), 41 uM (GTP) connH= 1.6 y Km ATP-Mn= 37 uM, Vmax= 0.97 umoles/min/mg. 8) Se estudió también el efecto histerético deactivación de la enzima en la mezcla de reacción durantela determinación de la actividad de carboxilaciónencontrándose una relación entre dicho efecto y laconcentración proteica de la muestra enzimáticaestudiada. El efecto de histéresis desaparecia cuando laenzima se sometía a diálisis pero se recuperaba por elagregado de sales a la mezcla de reacción, siendo en esesentido el (NH4)2SO4 el más efectivo. 9) El quinolinato, catabolito del triptofano eintermediario en la síntesis de NAD+ fue un inhibidortanto de la actividad de intercambio como de la decarboxilación de la PEPCK aislada del T. cruzi. 10) Se estudió también el efecto de inhibidores deenzimas con grupos tioles encontrándose que la enzima esmuy sensible al efecto de los mercuriales orgánicos (CMS, FMA y PCMB)y también se inhibe significativamenteen presencia de O-Iodosobenzoato, NEM, Iodoacetamida y DTNB. La reversión de la inhibición con DTT indicó queesta última se debía a un efecto de los reactivos sobrelos grupos tioles.ll) No se encontraron distintas formas moleculares de laenzima utilizando la cromatografía líquida rápida paraproteínas. Tampoco pudieron encontrarse productos demenor tamaño provenientes del tratamiento de la enzimaaltamente purificada con la proteinasa cuantitativamentemás importante del T.cruzi. 12) Se estudió también una actividad oxaloacéticodecarboxilásica asociada a la PEPCK y que posiblementesea intrínseca de la enzima. Dicha actividad no fuemodificada significativamente por los nucleósidosdifosfato. Con respecto al efecto de los metales seobservó una activación en presencia de Cd^(2)+ y de Mn^(2)+ pero sólo cuando la concentración de los metalesera menor de 50 uM. 13) Se puso de manifiesto la presencia en epimastigotesde T. cruzi de una actividad oxaloacéticodecarboxilásica independiente de la PEPCK y altamenteactivable por Cd^(2)+. Dicha actividad se encontró en mayorproporción en extractos provenientes del tratamiento delas células por congelamiento y descongelamientopermaneciendo la mayor proporción de la actividadcarboxiquinásica en el sedimento de dicho tratamiento. La cromatografía en ATP-agarosa de dicho extractopermitió una separación parcial de ambas actividades (carboxiquinásica y oxaloacético decarboxilásicadependiente de Cd^(2)+). La curva de pH para el extractoproveniente del tratamiento por congelamiento ydescongelamiento mostró dos máximos para la actividad 0D (Cd2+) [5.4 y 6.65] y uno para la actividad OD enausencia de metal [5.4]. Fil: Cymeryng, Cora Beatriz. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. application/pdf https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2430_Cymeryng spa Universidad de Buenos Aires. 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