Desarrollo y producción de anticuerpos monoclonales y proteínas complejas en células animales

Fil: Acuña Intrieri, María Eugenia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Acuña Intrieri, María Eugenia
Otros Autores:	Alonso, Leonardo
Formato:	Tesis doctoral acceptedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica 2024
Materias:	Anticuerpos Proteínas Bioprocesos Células animales Ciencias de la vida
Acceso en línea:	http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=posgraafa&cl=CL1&d=HWA_7830 https://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/collect/posgraafa/index/assoc/HWA_7830.dir/7830.PDF
Aporte de:	Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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Aquí, la producción de los antígenos recombinantes virales Spike y RBD fueron cruciales para el desarrollo de vacunas a subunidad y la generación de sueros policlonales y mAbs, tanto para terapias como para tests diagnósticos. A raíz de la pandemia, y ante la demanda de las mencionadas herramientas biotecnológicas, en nuestro laboratorio hemos producido diversas proteínas y mAbs relacionados a COVID19. En particular, en esta tesis se presentan el desarrollo y caracterización de las proteínas Spike y su dominio RBD, su receptor celular ACE2 y 5 mAbs contra el antígeno viral RBD. Como aplicación inmediata de estos mAbs, también hemos desarrollado un ensayo de ELISA sándwich cuantitativo para el monitoreo de los bioprocesos de RBD y Spike en células mamíferas. Además, a lo largo de todo este trabajo también hemos abordado diversas estrategias para la optimización de los bioprocesos de nuestras moléculas, evaluando su eficiencia a través de la utilización de distintos medios de cultivo y suplementos (feeds) químicamente definidos junto con el análisis del medio condicionado para la identificación de metabolitos claves para el crecimiento celular o su productividad. Este análisis se realizó por medio de la técnica de resonancia magnética nuclear o RMN. Para ello fue necesario poner a punto la técnica, ensayando muestras de medios de cultivo clásicos de fórmula química conocida. Una vez validad la técnica, se procedió a evaluar su precisión frente a un biosensor de metabolitos. en muestras de bioproceso de un mAb biosimilar en producción a escala industrial. Posteriormente, tras establecer la metodología analítica, se llevó a cabo la optimización del proceso productivo de dos mAbs distintos mediante el reemplazo de medios de cultivo suplementados con suero animal o hidrolizados por medios o feeds químicamente definidos (QD). En una primera instancia trabajamos con el anticuerpo monoclonal anti-HER2 H39, anticuerpo candidato a biosimilar de Trastuzumab desarrollado por la empresa mAbxience. Dicho anticuerpo es expresado de manera estable en células CHO y producido con medios libres de suero. El nuevo bioproceso implementado, íntegramente realizado con medios y feeds QD, incrementó el rendimiento de producción ~20%. El segundo anticuerpo en estudio fue el mAb murino anti-RBD 80E12 desarrollado en esta tesis. En este caso, la línea de hibridoma productora de este anticuerpo se adaptó al crecimiento en suspensión y a un medio químicamente definido. Mediante este sistema se obtuvo un rendimiento 3,5 veces mayor al obtenido con el cultivo estático tradicional suplementado con SFB. En cuanto al desarrollo de proteínas relacionadas a COVID19 se produjeron los antígenos virales RBD Wuhan, y Omicron, Spike y su receptor celular ACE2. Para ello se utilizó la transfección transiente de células HEK293 cultivadas en suspensión y con medios químicamente definidos libres de SFB. La identidad e integridad de las proteínas se caracterizó por ensayos de Western Blot y cromatografía de exclusión molecular y la funcionalidad por ensayos de ELISA. La optimización de la producción de estas proteínas se evaluó por medio de la utilización de medios de cultivo comerciales alternativos y la adición de moléculas conocidas por incrementar la expresión (enhancers). El desarrollo de mAbs anti-RBD, por su lado, comprendió la generación de anticuerpos con diferentes especificidades. Para ello, se inmunizaron ratones con 2 adyuvantes de propiedades diferentes: el adyuvante de Freund y sales de hidróxido de aluminio (alum). Del plan de Freund se obtuvieron las líneas de hibridomas productoras de los mAbs 67A5, 38B5 y 86G5, los cuales reconocen a las proteínas RBD Wuhan y BA.1 tanto en estado nativo como desnaturalizado. Curiosamente, ninguno de estos anticuerpos es capaz de reconocer a la proteína Spike, ni en estado nativa como desnaturalizada. Del plan de alum se obtuvieron 2 líneas de hibridomas, productoras de los mAbs 68E4 y 80E12. Estos mAbs reconocen exclusivamente la proteína RBD en estado nativo, señalando que están dirigidos contra epitopes discontinuos o estructurales de la proteína. Estos mAbs, además, reconocen la variante RBD BA.1 con reactividad similar a RBD Wuhan y son capaces de unirse al dominio RBD dentro del contexto del ectodominio Spike. Los patrones de reactividad diferencial de los mAbs contra la proteína RBD en estado nativa y/o desnaturalizada son congruentes con la acción de cada adyuvante sobre la conformación del antígeno reportada en la bibliografía. Se estableció un ensayo de ELISA sándwich para la cuantificación de RBD y Spike en muestras de bioprocesos utilizando como reactivos los mAbs 80E12 y 68E4 como par de captura-detección respectivamente y los antígenos COVID19 producidos. Los parámetros obtenidos de la validación del ensayo indicaron que su performance es completamente comparable con ensayos comerciales con el mismo principio. En conjunto, los resultados de la presente tesis muestran el desarrollo y la puesta a punto de novedosas técnicas analíticas orientadas a la optimización y el monitoreo de bioprocesos y la implementación de estrategias valiosas para la producción de proteínas heterólogas y mAbs con aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico expresados de manera transiente y estable en células mamíferas. application/pdf Wolman, Federico Cuestas, María Lujan De Marzi, Mauricio Anticuerpos Proteínas Bioprocesos Células animales spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica info:eu-repo/semantics/openAccess http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/ Ciencias de la vida Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias Bioquímicas Desarrollo y producción de anticuerpos monoclonales y proteínas complejas en células animales info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/acceptedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=posgraafa&cl=CL1&d=HWA_7830 https://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/collect/posgraafa/index/assoc/HWA_7830.dir/7830.PDF

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