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Fil: Bernardi, Andrés. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argeentina
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Facultad de Farmacia y Bioquímica
2019
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I28-R145-HWA_70402024-03-07 ... Fil: Bernardi, Andrés. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argeentina Facultad de Farmacia y Bioquímica Oubiña, José Raúl Bernardi, Andrés 2019-12-02 El virus hepatitis C (HCV por sus siglas en inglés) es una de las principales causas de hepatitis virales en el ser humano. Se estima que alrededor de 71 millones de personas en el mundo están infectadas con el HCV. Alrededor de un 10-30% de las infecciones se resuelven en la etapa aguda, mientras que la mayoría de los individuos infectados desarrolla -en ausencia de un tratamiento eficaz- una infección crónica. Esta lesión persistente puede devenir en una cirrosis al cabo de 10 años en un 5 ? 10 % de los pacientes. Eventualmente, algunos de estos pacientes cirróticos pueden progresar al hepatocarcinoma (HCC) al cabo de aproximadamente otros 5 años de evolución. No existe aún una vacuna para prevenir la infección por el HCV. Hasta 2014, la terapéutica combinada de PEG-IFN (interferón pegilado) más ribavirina administrada por hasta 48 semanas era el tratamiento habitualmente instituido a nivel mundial, al que le sucedía una disímil respuesta del huésped según el genotipo del HCV involucrado y la producción propia de IL-28B (IFN-?3) e IFN- ?4. El surgimiento de antivirales de acción directa (AADs), dirigidos contra proteínas virales imprescindibles para la replicación del HCV, modificó en forma sustancial las estrategias terapéuticas contra este agente. Las proteínas ABC (ATP Binding Cassette transporters) integran una de las mayores y más antiguas familias de proteínas conocidas, habiéndose descripto miembros de esta familia en diversos organismos (desde bacterias hasta los seres humanos). Estas proteínas transportan una gran variedad de sustratos (glúcidos, proteínas, iones metálicos, aminoácidos, lípidos, metabolitos, etc.) a través de membranas intracelulares y también hacia el exterior de la célula. Durante muchos años se relacionó a dichas proteínas y a su actividad de bombas de eflujo, con la quimio-resistencia observada en múltiples tumores. Un miembro de esta súper-familia de proteínas, MRP4 (ABCC4) es inducida compensatoriamente durante la colestasis. Además, niveles elevados de esta proteína han sido detectados luego de la exposición a compuestos hepatotóxicos, lo cual sugiere que tendría una función protectora para el hepatocito. Continuamente se están desarrollando nuevas estrategias para optimizar la terapéutica antiviral y antitumoral, dentro de las cuales, la nanotecnología ha adquirido una gran relevancia. Recientemente, se comenzó a evaluar -como posible estrategia- la formulación de compuestos donde el principio activo esté acompañado de co-polímeros segmentados de poli (óxido de etileno) (PEO) y poli (óxido de propileno) (PPO), ya sea en forma de unímeros o como micelas poliméricas. Dentro de la gran variedad de polímeros que se utilizan en la actualidad para aplicaciones biomédicas, Pluronic® F127 es uno de los que más relevancia ha adquirido, debido a su amplia variedad de posibles aplicaciones. Una de las más estudiadas de F127, es la modulación de las proteínas ABC, lo que lo hace muy atractivo como adyuvante en la formulación de fármacos antineoplásicos y antivirales. Uno de los objetivos de la presente Tesis, fue estudiar el efecto de la expresión de diferentes proteínas del HCV sobre la expresión del ARN mensajero (ARNm) de mrp4 en líneas celulares de estirpe hepatocitaria. Como modelo experimental se utilizaron las líneas celulares Huh 7.5 SG -que mantiene en forma autónoma la replicación del ARN subgenómico del HCV y expresa sólo las proteínas no estructurales del virus-, y como control, la Huh 7.5 (células Huh 7 infectadas con el HCV y tratadas con interferón). Se pudo observar que en la línea celular Huh 7.5 SG, la expresión relativa del ARNm de mrp4 es menor cuando se la compara con la expresión en Huh 7.5. Esto podría relacionarse con una menor capacidad de respuesta del hepatocito infectado por el HCV para la detoxificación frente a cuadros de colestasis. Una vez observada esta diferencia en el sistema experimental, se procedió a evaluar el efecto de las proteínas NS5A y Core del HCV sobre la actividad del promotor de mrp4 en la línea celular Huh 7.5. Ambas proteínas tienen diversos y numerosos efectos sobre distintas vías de señalización celular, como también en la inhibición/estimulación de la expresión de varias proteínas celulares. Mediante ensayos con el gen reportero luciferasa, se pudo determinar que tanto Core como NS5A, ejercen un efecto supresor sobre la actividad del promotor de mrp4. Este último resultado, es congruente con la menor expresión relativa del ARNm de mrp4 en Huh 7.5 SG. Finalmente, se determinó el efecto del poloxámero F127 sobre la replicación viral del HCV en Huh 7.5 SG, así como sobre la expresión del ARNm de mrp4 en las líneas celulares Huh 7.5 y Huh 7.5 SG. En primer término, se observó una significativa disminución de la carga viral del HCV en el medio extracelular de los cultivos de Huh 7.5 SG tratados con F127 al 1%. Este efecto fue comparable en magnitud a lo observado utilizando un antiviral de eficacia comprobada (Interferón ?-pegilado). Sorprendentemente, dicho efecto no se tradujo en una modificación en los niveles de expresión relativa del ARNm de mrp4, lo que sugeriría que la regulación negativa de la replicación viral ejercida por F127 (disminución de 0,5 ? 1 log UI ARN HCV / ml) fue insuficiente para revertir en los hepatocitos el efecto deletéreo promovido por el remanente de proteínas no-estructurales del HCV sobre el promotor de mrp4. Estos estudios iniciales desarrollados in vitro ponen de manifiesto un efecto supresor de las proteínas virales NS5A y Core sobre el promotor de mrp4 (no descripto previamente), lo que representa una posible explicación mecanística respecto a la expresión relativa disminuida del ARNm de mrp4 en Huh 7.5 SG. Además, el efecto antiviral de F127, constituye un muy promisorio punto de partida para estudiar formulaciones polímero-antiviral, evaluar su eficacia y compararla con las de las AADs actualmente administradas como tratamiento de la hepatitis C crónica. application/pdf Damonte, Elsa Beatriz Ramanowski, Victor Martinez Peralta, Liliana Hepatitis C Poloxamero F127 MRP4 Proteínas spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica info:eu-repo/semantics/openAccess http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/ Ciencias de la vida Desarrollo y evaluación de nuevas formulaciones terapéuticas para la hepatitis C : rol del poloxámero F127 sobre la replicación viral y la resistencia antiviral mediada por proteínas ABC info:eu-repo/semantics/masterThesis info:ar-repo/semantics/tesis de maestría info:eu-repo/semantics/acceptedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=afamaster&cl=CL1&d=HWA_7040 http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/collect/afamaster/index/assoc/HWA_7040.dir/7040.PDF |