Efecto de surfactantes sobre la estabilidad y actividad catalítica de una proteína de membrana hipertermófila

Membrane proteins represent about 25% - 30% of the total proteins codified in known genomes. However, the Study of their stability has not received as much attention compared to soluble proteins. Despite helical membrane proteins appear to be resistant to chemical denaturation, ionic detergents such...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Recoulat Angelini, Alvaro Agustin
Otros Autores: Gonzalez Flecha, Luis
Formato: Tesis doctoral acceptedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica 2020
Materias:
Proteínas
Membrana
SDS
Estabilidad
Ciencias de la vida
Acceso en línea:http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=posgraafa&cl=CL1&d=HWA_6415
https://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/collect/posgraafa/index/assoc/HWA_6415.dir/6415.PDF
Aporte de:
Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires
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description Membrane proteins represent about 25% - 30% of the total proteins codified in known genomes. However, the Study of their stability has not received as much attention compared to soluble proteins. Despite helical membrane proteins appear to be resistant to chemical denaturation, ionic detergents such as SDS have been shown to be efficient denaturants for some of them. It this work, we evaluated the SDS induced denaturation of a Cut(I) transport ATPase of the hyperthermophilic microorganism Archaeoglobus fulgidus. This surfactant was used to characterize the thermodynamic stability of the complete protein and the isolated catalytic domain. The results suggest that the interaction occurs with the presence of multiple intermediaries. The comparative analysis allowed us to propose a mechanism for the denaturation process.
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Buenos Aires, Argentina Gonzalez Flecha, Luis Recoulat Angelini, Alvaro Agustin 2020-02-28 Las proteínas de membrana constituyen aproximadamente un tercio de las proteínas\ncodificadas en genes conocidos. Dado su rol funcional como receptores del ambiente\nextracelular, la mayor parte de los productos farmacéuticos en desarrollo las tiene como blanco. Sin embargo, el conocimiento de los factores que estabilizan su estructura presenta un avance muy lento al compararlo con el correspondiente a las proteínas solubles. Una de las razones es la particular resistencia que presentan las proteínas integrales de membrana del tipo ? helicoidal a la desnaturalización química por agentes como la urea o el cloruro de guanidinio. Sin embargo, el uso de surfactantes, como el dodecilsulfato sódico (SDS), ha resultado ser una alternativa eficaz para su desnaturalización. La naturaleza anfifilica de los detergentes combina la posibilidad de perturbar la estructura terciaria y solubilizar elementos de la estructura secundarias ocultas dentro de las membranas biológicas.\nEn este trabajo, se caracterizó el efecto del SDS sobre la estabilidad y la actividad catalítica de una ATPasa transportadora de Cu (I) del microorganismo hipertermofilo Archaeglobus fulgidus (AfCopA), y de su dominio catalítico soluble que une e hidroliza ATP (PNAfCopA). AfCopA, reconstituida en micelas mixtas de detergente (C12E10) y fosfolípidos (asolectina), se incubó con concentraciones crecientes de SDS. La interacción produjo una disminución de la señal de fluorescencia intrínseca, debido a un cambio estructural a nivel del entorno de los residuos de triptófano. A su vez, utilizando la sonda fluorescente ANS (ácido 1- anilinonaftaleno- 8-sulfonico), se observó que su fluorescencia disminuye en un 50% respecto de la señal en ausencia de SDS. Debido a que la sonda se une preferentemente a la región transmembrana, la disminución en su rendimiento cuántico indicaría una pérdida en la organización estructural de esa región. Por otro lado, al evaluar la elipticidad en el UV lejano, se observó que la adición de SDS no genera cambios significativos en la estructura secundaria. Todos los cambios observados fueron revertidos al diluir el desnaturalizante, permitiendo realizar un análisis termodinámico de la desnaturalización. Se ajustó un modelo de tres estados con la presencia de un intermediario a los datos de fluorescencia intrínseca, y para la transición entre el estado inicial y el final se obtuvieron valores de ?G°W y m de 31 kJ mol-1 y 68 kJ mol-1 M-1, respectivamente, con un valor de ?Cp de 3.7 kJ mol-1 K-1. Estos valores son inferiores a los observados para proteínas solubles de similar peso molecular. El bajo valor estimado de ?Cp podría relacionarse con la adaptación a temperaturas elevadas. Al tratarse de una macromolécula multidominio, se trabajó con el domino catalítico soluble aislado, para estudiar los efectos del SDS sobre esta región y compararlos con los correspondientes a la proteína completa. La interacción entre PN-AfCopA y SDS produjo una disminución en la señal de fluorescencia intrínseca con un desplazamiento en el máximo del espectro hacia longitudes de onda menores, indicando que las moléculas de SDS interaccionan cerca del residuo de triptófano, generando un ambiente hidrofóbico. Al igual que en la proteína completa, la elipticidad en el UV lejano no varía significativamente al agregar SDS, revelando que la proteína desnaturalizada mantiene su estructura secundaria. Los cambios observados ocurrieron a concentraciones de SDS por debajo de la concentración micelar critica (CMC) y fueron revertidos al remover el detergente. La desnaturalización seguida por fluorescencia intrínseca fue analizada con un modelo de dos estados obteniéndose ?G°w de 20 kJ mol-1 y un m de 80 kJ mol-1 M-1, respectivamente, y un valor de ?Cp de 7 kJ mol-1 K-1. Estos valores son comparables con los observados en proteína solubles de la masa molecular de PN-AfCopA. Sin embargo, el uso de la sonda fluorescente ANS reveló que el estado final analizado por fluorescencia intrínseca es en realidad un intermediario en la desnaturalización, con una estructura del tipo ?globulo fundido?. Se evaluó el efecto del SDS sobre la actividad ATPasa de AfCopA y PN-AfCopA. La interacción provocó una inactivación reversible, donde la proteína completa se inactiva a concentraciones de SDS en las que no se observan cambios en la actividad del dominio catalítico aislado, indicando que la desorganización de la región transmembrana afecta la actividad ATPasa dependiente de cobre en AfCopA.\nPara evaluar la interacción a nivel global, se utilizó calorimetría de titulación isotérmica.\nEsta técnica reveló la presencia de multiples intermediarios en la interacción entre SDS y PNAfCopA, a concentraciones de SDS libre menores a la CMC. Se obtuvo la estequiometría de cada uno, y se observó que los cambios en la señal de fluorescencia intrínseca corresponden a la interacción de la proteína con 3 moléculas de SDS. El estado final identificado presenta una estequiometría de una molécula de SDS cada dos aminoácidos. Las contribuciones de las señales de fluorescencia intrínseca y de ANS del dominio a las correspondientes a la proteína completa son bajas y por lo tanto es probable que en el análisis de la estabilidad de la proteína completa se subestime la cantidad de intermediarios. Al focalizarnos en esta región aislada fue posible explorar con mayor detalle el mecanismo por el cual el SDS perturba su estructura y funcionalidad. El análisis comparativo entre ambas proteínas posibilitó obtener una caracterización mas completa del proceso de desnaturalización de AfCopA. application/pdf Puntarulo, Susana Wetzler, Diana Ermácora, Mario Proteínas Membrana SDS Estabilidad spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica info:eu-repo/semantics/openAccess http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/ Ciencias de la vida Doctor de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias Biológicas Efecto de surfactantes sobre la estabilidad y actividad catalítica de una proteína de membrana hipertermófila info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/acceptedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=posgraafa&cl=CL1&d=HWA_6415 https://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/collect/posgraafa/index/assoc/HWA_6415.dir/6415.PDF

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